Verbeterde biocompatibiliteit in anodische TaO x Nanotube-arrays

Abstract

Deze studie onderzoekt eerst de biocompatibiliteit van zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisarrays met verschillende nanobuisdiameters vervaardigd door elektrochemische anodisatie. Allemaal zoals geanodiseerd TaO_x nanobuisjes werden geïdentificeerd als een amorfe fase. De overgang in oppervlaktebevochtigbaarheid met TaO_x nanobuisdiameters kunnen worden verklaard op basis van het model van Wenzel in termen van geometrische ruwheid. In vitro biocompatibiliteitsevaluatie geeft verder aan dat fibroblastcellen een duidelijk bevochtigbaarheidsafhankelijk gedrag vertonen op de TaO_x nanobuisjes. De TaO_{x . met een diameter van 35 nm} nanobuisarrays onthullen de hoogste biocompatibiliteit van alle monsters. Deze verbetering kan worden toegeschreven aan zeer dichte brandpunten die worden geleverd door TaO_x nanobuisjes vanwege de hogere hydrofiliciteit van het oppervlak. Dit werk toont aan dat de biocompatibiliteit in Ta kan worden verbeterd door TaO_{x te vormen} nanobuisarrays op het oppervlak met de juiste nanobuisdiameter en geometrische ruwheid.

Achtergrond

Tantaal (Ta) is een zeldzaam, hard, zeer corrosiebestendig en bioinert metaal [1,2,3]. Oxidatie van het tantaalmateriaal, door het vormen van een zeer dunne, ondoordringbare oxidefilm op het oppervlak, draagt bij aan de biocompatibiliteit. De hoge flexibiliteit en biocompatibiliteit van tantaal maken zijn klinische toepassingen mogelijk, zoals tandheelkundige implantaten, orthopedische implantaten en botreconstructie [4,5,6]. Onlangs werd gevonden dat tantaal een betere biocompatibiliteit heeft dan titanium, zoals overvloedigere extracellulaire matrixvorming, uitstekende cellulaire hechting en groei, en een veel hogere levende celdichtheid op het oppervlak [7,8,9]. Aan de andere kant hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat de onderscheidende fysisch-chemische eigenschap van nanogestructureerde oppervlaktegeometrie de belangrijkste factor is die het celgedrag beïnvloedt [10,11,12]. Het ideale oppervlak van biomateriaal zou de optimale omgeving voor celingroei moeten kunnen bieden. Rukh et al. toonde aan dat geanodiseerde Ta-nanobuisjes een substraat vormen voor verbeterde osseo-integratie in vergelijking met een plat oppervlak [13]. Een recent ontwikkeld poreus tantaalmateriaal, dat de eigenschappen van bot nabootst, zorgt voor de ingroei van zacht weefsel en bot, wat zorgt voor een goede biologische fixatie [14,15,16,17]. De hoge stabiliteit en het genezingspotentieel van poreus tantaal helpen om de openingen tussen botstructuren samen te smelten tijdens reconstructieve chirurgie. Het poreuze tantaal kreeg dus weer veel belangstelling op het gebied van biomateriaal vanwege de verschillende voordelen in vergelijking met andere transplantaten, zoals geen morbiditeit op de donorplaats, hoge stabiliteit, uitstekende osseo-integratieve eigenschappen en preventie van mogelijk risico op overdracht van infectieziekten [18,19,20 ,21]. Een recent klinisch onderzoek toonde aan dat patiënten die poreuze tantaal heupkomcups kregen een hogere mate van implantaatfixatie hadden dan degenen met met hydroxyapatiet gecoate titanium (Ti) cups [22,23,24,25].

Onlangs hebben we zelfgeorganiseerde TiO₂ . ontwikkeld nanobuisjes met verschillende diameters door gebruik te maken van een elektrochemische anodisatiemethode [26, 27]. We ontdekten dat menselijke fibroblastcellen meer voor de hand liggend diameterspecifiek gedrag vertonen op de superkritische CO₂ (ScCO₂ )-behandelde nanobuisjes dan die op de als-geanodiseerde [27]. We hebben verder met Ag versierde TiO₂ . gefabriceerd nanobuisjes door de elektronenstraalverdampingsmethode en vonden de kleinste diameter (25 nm-diameter) Ag-gedecoreerde nanobuisjes vertoonden de meest voor de hand liggende biologische activiteit bij het bevorderen van adhesie en proliferatie van menselijke fibroblasten en ook menselijke neusepitheelcellen [26]. In deze studie hebben we TaO_{x . gefabriceerd} nanobuisjes met verschillende diameters door de gelijkaardige elektrochemische anodisatiemethode. Het celgedrag, inclusief celadhesie en proliferatie, in reactie op de diameter van TaO_x nanobuisjes werden onderzocht. Het doel van dit onderzoek is het bestuderen van de biocompatibiliteit van zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisarrays met verschillende nanobuisdiameters vervaardigd door elektrochemische anodisatie.

Methoden

Voorbereiding van TaO_x Nanobuisjes

Ta-vellen werden gekocht bij ECHO Chemical (dikte 0,127 mm, zuiverheid 99,7%, CAS-nr. 7440-25-7). Vóór het anodisatieproces werden Ta-vellen ultrasoon gereinigd in aceton, isopropanol, ethanol en water. Alle anodisatie-experimenten werden uitgevoerd bij 20 ° C in zwavelzuuroplossing die 4,9 gew.% HF bevatte, die was bereid uit chemicaliën van reagenskwaliteit en gedeïoniseerd water. Een elektrochemische cel met twee elektroden met Ta als anode en Pt als tegenelektrode werd gebruikt. De spanningen werden aangepast van 10 tot 40 V om te resulteren in TaO_x nanobuisdiameters variërend van 20 tot 90 nm. Bestraling met UV-licht van lage intensiteit (ongeveer 2 mW/cm² ) met fluorescerende black-light-lampen op TaO_x nanobuismonsters gedurende 8 uur werden gedaan vóór de biocompatibele tests.

Materiaalkarakterisering

De oppervlaktemorfologie, binnen- en buitendiameter, wanddikte en lengte van TaO_x nanobuisjes werden gekarakteriseerd door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Röntgendiffractie (XRD) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) uitgerust met een energiedispersiespectrometer (EDS) werden gebruikt om de kristallijne structuur van de TaO_{x te onderzoeken} arrays van nanobuisjes. Er werden contacthoekmetingen uitgevoerd om de bevochtigbaarheid van het oppervlak van de TaO_{x . te evalueren} nanobuismonsters door de extensiemethode met behulp van een horizontale microscoop met gradenboogoculair. Water en kweekmedium werden gebruikt als testvloeistoffen voor de metingen.

Menselijke fibroblastcelcultuur

MRC-5 humane fibroblasten (BRCC, Bioresource Collection and Research Center, Hsinchu, Taiwan, BCRC No. 60023) werden uitgeplaat in een weefselkweekplaat van 10 cm en gekweekt met Eagle's minimaal essentieel medium (Gibco) dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevatte. ), 2 mM l-glutamine, 1,5 g/L natriumbicarbonaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 1,0 mM natriumpyruvaat en in 5% CO₂ bij 37 °C. Cellen werden vervolgens uitgezaaid op de geautoclaveerde TaO_x vellen die op de bodem van een kweekplaat met 12 putjes (Falcon) zijn geplaatst voor verder onderzoek.

Celadhesietest

Cellen werden gezaaid op elke TaO_x vel met een dichtheid van 2,5 × 10³ cellen/cm² en geïncubeerd in 5% CO₂ bij 37 ° C gedurende 3 dagen en tweemaal gespoeld met PBS. De hechtende cellen op het substraat werden gedurende 1 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wassingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en permeabilisatie met 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) in PBS gedurende 15 minuten bij 4 °C. Na wassen met PBS werd het actinefilament gelabeld door 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met rhodamine-phalloidin (Life Technologies). Vervolgens werden celkernen gekleurd door gedurende 5 minuten te incuberen met diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Thermo FisherScientific). Cellen werden geanalyseerd onder een fluorescentiemicroscoop (AX80, Olympus) om de celadhesiemorfologie en cytoskeletrangschikking te onderzoeken. Voor SEM-observatie werden cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde-oplossing (Merck), vervolgens tweemaal gespoeld in PBS-oplossing, gedehydrateerd in een reeks ethanol (40, 50, 60, 70, 80, 90 en 100 %) en kritisch punt gedroogd met een kritisch punt droger (CPD 030, Leica). Voorafgaand aan SEM-waarneming werd een dunne platinafilm op de monsters aangebracht.

Celproliferatietest

Cellen werden gezaaid op elke TO_x substraten met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/cm² en gekweekt voor 1 week. Na 1 week werden de monsters tweemaal met PBS gespoeld en werd de celproliferatie geschat met behulp van WST-1-reagenskit (Roche, Penzberg, Duitsland). Het medium met 10% WST-1 celproliferatiereagens werd aan elk monster toegevoegd en geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO₂ bij 37 ° C gedurende 2 uur. De oplossing van elk putje werd overgebracht naar een plaat met 96 putjes. De absorptie van de oplossing werd gemeten bij 450 nm met behulp van de spectrofotometer (Spectral Max250).

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en er werden ten minste drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en geanalyseerd door analyse van varianties (ANOVA) met behulp van SPSS 12.0-software (SPSS Inc.). Een p waarde van < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Afbeelding 1a–e toont de SEM-afbeeldingen van de platte Ta-folie en de geanodiseerde TaO_x nanobuisarrays met een gemiddelde nanobuisdiameter van respectievelijk 20, 35, 65 en 90 nm. Allemaal zoals geanodiseerd TaO_x nanobuisjes vertonen een goed gedefinieerde nanobuisstructuur en hun nanobuisdiameters waren bijna evenredig met de aangelegde spanningen. Van deze monsters vertonen de nanobuisjes met een diameter van 20 nm een relatief onduidelijk nanobuisvormig oppervlak, zoals weergegeven in het vergrote gebied uit figuur 1b. Deze waarneming kan worden toegeschreven aan de zwakkere veldsterkte bij laagspanningsbedrijf in het anodisatieproces. Afbeelding 2 toont verder de kruissessie van alle TaO_x nanobuisjes en hun corresponderende nanobuisjes. XRD- en TEM-analyses werden gebruikt om de TaO_{x . verder te identificeren} nanobuis kristalliniteit. Zoals getoond in de XRD-spectra van Fig. 3a, worden alleen pieken met betrekking tot de Ta-folie waargenomen (JCPDS-kaart nr. 04-0788), wat suggereert dat als-geanodiseerd TaO_x nanobuisjes zijn mogelijk een amorfe fase. Afbeelding 3b toont een representatief TEM-beeld genomen van een TaO_{x met een diameter van 90 nm} nanobuis afgepeld van het geanodiseerde monster, waardoor een goed gedefinieerde nanotubulaire structuur werd onthuld. Het smetteloze diffractiepatroon in de inzet bevestigt dat de TaO_x nanobuisjes zijn niet-kristallijn.

SEM-afbeeldingen met de a Ta-folieoppervlak en zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisjes met een diameter van b 20, c 35, d 65, en e respectievelijk 90 nm

SEM-afbeeldingen die de dwarsdoorsneden van TaO_{x . tonen} nanobuisjes met een diameter van a 20, b 35, c 65, en d respectievelijk 90 nm

een XRD-spectra van geanodiseerd TaO_x nanobuisjes met verschillende diameters en b TEM-afbeelding genomen van een als-geanodiseerde TaO_x nanobuis met een diameter van 90 nm. De inzet toont ook het bijbehorende diffractiepatroon

De vorige studie heeft gemeld dat celhechting, verspreiding en cytoskeletorganisatie significant beter zijn op hydrofiele oppervlakken in vergelijking met hydrofobe oppervlakken [28]. Das et al. gaf verder aan dat een lage contacthoek een hoge oppervlakte-energie impliceert, wat ook een cruciale factor is die bijdraagt aan een betere celhechting [29]. Het is dus essentieel om de invloed van TaO_{x . te begrijpen} nanobuistopografie op de bevochtigbaarheid van het oppervlak. Zoals getoond in Fig. 4, alle as-geanodiseerde TaO_x nanobuisjes zijn zeer hydrofiel omdat hun contacthoeken veel kleiner zijn dan 90 °. Bovendien bleken hun contacthoeken monotoon af te nemen met afnemende nanobuisdiameter tot 35 nm en vervolgens omgekeerd toe te nemen naarmate de diameter afneemt tot 20 nm. We vinden ook dat de TaO_x nanobuismonsters vertonen dezelfde trend bij gebruik van water of kweekmedium als testvloeistof. We proberen het waargenomen bevochtigingsgedrag te verklaren op basis van de wet van Wenzel, die de kleine contacthoek op hydrofiele materialen beschrijft [30]. In het model van Wenzel zal een toename van de oppervlakteruwheid in hydrofiel materiaal resulteren in een kleinere contacthoek en zal water de groeven onder de druppel vullen. Hier gebruiken we de ruwheidsfactor, d.w.z. het fysieke oppervlak van nanobuisjes per eenheid geprojecteerd oppervlak, om de geometrische ruwheid van TaO_{x te evalueren} nanobuisjes [31]. Zoals weergegeven in Afb. 5, met binnendiameter D , wanddikte W , en nanobuislengte L , de puur geometrische ruwheidsfactor G kan worden berekend als [4πL {D + W }/ {√3(D .) + 2 W) ² }] + 1. Deze berekening gaat ervan uit dat alle oppervlakken van de nanobuisjes perfect glad zijn. De berekende ruwheidsfactoren voor alle nanobuismonsters zijn samengevat in de tabel van Fig. 5. Behalve het monster met een diameter van 20 nm, hebben de nanobuisjes met een kleinere diameter de grotere geometrische ruwheid en daarom wordt aangenomen dat ze een betere hydrofiliciteit vertonen volgens het model van Wenzel. Deze gevolgtrekking komt overeen met ons resultaat dat de contacthoek afneemt met afnemende nanobuisdiameter tot 35 nm. Het verklaart ook goed dat de nanobuisjes met een diameter van 20 nm die een relatief onduidelijk nanobuisoppervlak vertonen, een kleinere geometrische ruwheid en een slechtere hydrofiliciteit vertonen dan andere.

een –j Optische beelden van water- en kweekmediumdruppels op de a ,f Ta-folieoppervlak en zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisjes met een diameter van b ,g 20, c ,u 35, d,i 65, en e ,j respectievelijk 90nm. Contacthoeken worden aangegeven in de afbeeldingen

Schematisch diagram van een geïdealiseerde nanotubulaire structuur met binnendiameter D , wanddikte W , en nanobuislengte L . De berekende ruwheidsfactoren voor alle nanobuisjes in dit onderzoek zijn samengevat in de tabel

Het gedrag van menselijke fibroblastcellen als reactie op de platte Ta-folie en TaO_x nanobuisarrays werden verder bestudeerd. Om de aanhechting van fibroblastcellen op de TaO_{x . te evalueren} nanobuisjes, cytoskeletactine werd gekleurd met rhodamine-phalloidin om rode fluorescentie tot expressie te brengen en kernen gekleurd met DAPI om blauwe fluorescentie tot expressie te brengen. De actine-immunokleuring toont een onderscheidbare cel-materiaal contactmorfologie voor de platte Ta-folie en TaO_x nanobuisjes met verschillende diameters (zie figuur 6). Het is algemeen bekend dat cellen zich eerst aan het materiaaloppervlak moeten hechten en zich daarna moeten verspreiden voor verdere celdeling. Betere celadhesie kan meer activering van intracellulaire signaalcascades veroorzaken door integrine gekoppeld aan actine-cytoskelet [32,33,34]. FE-SEM werd gebruikt voor de gedetailleerde observatie van celadhesie (zie figuur 7). De fibroblasten met een diameter van 35 nm onthullen een uitstekende celadhesie met een langwerpige, platte morfologie. Aan de andere kant, die fibroblasten op de Ta-folie en TaO_{x met een diameter van 90 nm} nanobuisjes vertonen minder aangehechte cellen en tot op zekere hoogte een gebrek aan celverspreiding. Het dekkingsgebied van cellen op de nanobuisjes werd verder geschat met behulp van ImageJ-software en genoteerd in deze SEM-afbeeldingen. Net als bij de trend van contacthoeken, bleek het dekkingsgebied monotoon af te nemen met afnemende nanobuisdiameter tot 35 nm en vervolgens omgekeerd toe te nemen naarmate de diameter afneemt tot 20 nm. De TaO_{x . met een diameter van 35 nm} nanobuis toont inderdaad het grootste celdekkingsgebied. Het is bekend dat cellen oppervlaktekenmerken herkennen wanneer een geschikte plaats voor adhesie is gedetecteerd. Er wordt verondersteld dat cellen hun contacten kunnen stabiliseren op de TaO_x nanobuisjes door focale adhesies en rijpe actinevezels te vormen, gevolgd door het rekruteren van tubuline-microtubuli [35]. Het actine-cytoskelet is gekoppeld aan integrines die zich binnen de verklevingen bevinden. Onze bevindingen suggereren dat het cytoskelet op de nanobuisjes met een diameter van 35 nm beter zou kunnen worden gevormd dan die op de platte Ta-folie of andere TaO_x nanobuis-arrays.

Fluorescentiemicroscopiebeelden van de fibroblastcelaanhechting op de a Ta-folie en zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisjes met een diameter van b 20, c 35, d 65, en e respectievelijk 90 nm. De rode fluorescentie geeft het actinefilament van het cytoskeleteiwit aan en de blauwe fluorescentie geeft kernen aan

een –e SEM-beelden die de celadhesie en proliferatie van menselijke fibroblastcellen op de a . tonen Ta-folieoppervlak en zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisjes met een diameter van b 20, c 35, d 65, en e respectievelijk 90nm. De dekkingsgebieden van cellen op de monsters geschat door ImageJ-software worden aangegeven in de afbeeldingen

De WST-1-assay werd gebruikt om de proliferatie van fibroblastcellen op de TaO_{x verder te evalueren.} nanobuisjes met verschillende diameters. Afbeelding 8 toont de vergelijking van optische dichtheden gemeten aan de hand van de WST-1-assayresultaten. We vinden dat de celproliferatie het hoogst is voor de TaO_{x met een diameter van 35 nm} nanobuis monster. Er is echter geen significant verschil tussen Ta-groep en TaO_x arrays van nanobuisjes. Bovendien vertonen de celproliferatie en de bevochtigbaarheid van het oppervlak een bijna vergelijkbare trend met de TaO_x diameters van nanobuisjes. Deze waarneming suggereert dat niet alleen de diameter van de nanobuisjes, maar ook de bevochtigbaarheid van het oppervlak de celadhesie en de daaropvolgende verspreiding sterk beïnvloedt. Met andere woorden, vergeleken met de nanobuisjes met een diameter van 35 nm, kunnen de nanobuisjes met een diameter van 20 nm meer brandpunten voor fibroblastcellen geven, maar de slechtere hydrofiliciteit elimineert enkele effectieve focale contacten en belemmert dus de celhechting. Uiteindelijk zal de TaO_{x . met een diameter van 35 nm} nanobuisjes onthullen de hoogste biocompatibiliteit van alle monsters.

Optische dichtheden (QD) gemeten na het kweken van menselijke fibroblastcellen op de Ta-folie en zelfgeorganiseerde TaO_x nanobuisjes van verschillende diameters. De OD-waarden met hun standaarddeviaties worden weergegeven als een bijgevoegde tabel

Conclusies

Concluderend bestudeert dit werk de biocompatibiliteit van geanodiseerd TaO_x nanobuisjes met verschillende nanobuisdiameters. Allemaal geanodiseerd TaO_x nanobuisjes werden geïdentificeerd als voornamelijk amorfe fase. We bespreken de overgang in oppervlaktebevochtigbaarheid met TaO_x nanobuisdiameters gebaseerd op het model van Wenzel. In vitro biocompatibiliteitsevaluatie geeft verder aan dat fibroblastcellen een duidelijk bevochtigbaarheidsafhankelijk gedrag vertonen op de TaO_x arrays van nanobuisjes. De TaO_{x . met een diameter van 35 nm} nanobuisarrays onthullen de beste biocompatibiliteit van alle nanobuismonsters. Deze verbetering kan worden toegeschreven aan zeer dichte brandpunten die worden geleverd door TaO_x nanobuisjes vanwege de hogere hydrofiliciteit van het oppervlak. Deze studie toont aan dat de biocompatibiliteit in Ta kan worden verbeterd door TaO_{x te vormen} nanobuisarrays met geschikte nanobuisdiameter en geometrische ruwheid.