Koolstofnanodots als dual-mode nanosensoren voor selectieve detectie van waterstofperoxide

Resultaten en discussie

Karakterisering van de cd's

De morfologie van de zoals voorbereide CD's werd gemeten met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Zoals te zien is in figuur 1a, zijn de cd's goed verspreid met een uniform groottebereik van 2,5-6,5 nm en een gemiddelde diameter van ongeveer 5 nm (aanvullend bestand 1:figuur S1b). Bovendien toont het HRTEM-beeld (inzet van figuur 1a) de diffractieranden rond 0,21 nm, wat overeenkomt met de (100) van grafiet. De XRD-patronen van de CD's getoond in Fig. 1b vertonen een brede piek rond 23,4 °, wat overeenkomt met de zeer ongeordende koolstofatomen met een grafietachtige koolstofstructuur. De Raman-spectra van de cd's (afb. 1c) onthullen twee banden:D-band (ongeveer 1347 cm ⁻¹ , wat te wijten was aan de trillingen van sp ³ -gehybridiseerde koolstof met imperfectie en wanorde) en G-band (ongeveer 1577 cm ⁻¹ , die werd geassocieerd met de E_2g vibratiestanden van sp ² -gehybridiseerde koolstof in een tweedimensionale hexagonale kristalstructuur). De FTIR-spectra van de cd's (Fig. 1d) vertonen brede trillingsabsorptiebanden van O–H/N–H bij 3100–3600 cm ⁻¹ , de uitrekkende trillingen van C=O/C=C rond 1690–1610 cm ⁻¹ en de strekkende trillingen van N–O rond 1350–1390 cm ⁻¹ . De bovenstaande gegevens geven aan dat er enkele functionele groepen op het oppervlak van de CD's kunnen zijn, en deze functionele groepen kunnen een belangrijke rol spelen in de hoge hydrofiliciteit en stabiliteit van de CD's in waterige oplossing.

een TEM-afbeelding van de cd's. Inzetstukken laat het HRTEM-beeld van de cd's zien. b XRD-patroon van de cd's. c Raman-spectroscopie van de cd's. d FTIR-spectroscopie van de cd's. e Fluorescentievariatie van cd's na toevoeging van 0,5 M H₂ O₂ . Inzetstukken laat foto's zien van cd's ervoor (links ) en na (rechts ) de H₂ . toevoegen O₂ onder UV-licht. v Colorimetrische variatie van cd's na toevoeging van 0,5 M H₂ O₂ . Inzetstukken laat foto's zien van cd's ervoor (links ) en na (rechts ) de H₂ . toevoegen O₂ bij daglicht

Het fluorescerende gedrag van de op CD gebaseerde nanosensoren in de richting van H₂ O₂ werd gemeten in de CD-waterige oplossingen getoond in Fig. 1e. Onder een enkele golflengte-excitatie bij 365 nm illustreren de CD-oplossingen asymmetrische emissiespectra, die kunnen worden gemonteerd door fluorescerende banden met dubbele emissie gecentreerd op 450 en 500 nm, overeenkomend met respectievelijk blauwe en groene fluorescerende banden. Wanneer de CD-oplossingen worden gemengd met H₂ O₂ , vertoont de intensiteit van de blauwe band een grotere afname dan die van de groene. Dienovereenkomstig verschuiven de sterkste emissies van de cd's van 450 naar 500 nm van de resultaten van de excitatie-emissiematrices van de cd's na de toevoeging van de H₂ O₂ (Extra bestand 1:Figuur S2). Als gevolg hiervan verandert de fluorescentiekleur van de CD-oplossingen van blauw in groen onder een 365-nm UV-lampverlichting (inzet van Fig. 1e). Bovendien ervaren de CD-oplossingen gelijktijdig een colorimetrische verandering van donkerrood naar groen na toevoeging van de H₂ O₂ (inzet van Fig. 1f). Deze kleurverandering kan worden toegeschreven aan de intensiteitsevolutie van de absorptiebanden rond 555 en 595 nm, veroorzaakt door de toevoeging van H₂ O₂ in de CD-oplossing (Fig. 1f). Alles bij elkaar genomen bevestigen deze resultaten dat de cd's kunnen worden gebruikt als een dual-mode nanosensor voor de detectie van H₂ O₂ .

Waarnemingsmechanisme

Om het detectiemechanisme, de morfologie en fluorescentie-eigenschappen van de CD's te onderzoeken na toevoeging van H₂ O₂ werden ook gekenmerkt. Zoals geïllustreerd in Aanvullend bestand 1:Figuren S1a en S1c, de toevoeging van H₂ O₂ in de cd-oplossing kan leiden tot de aggregatie van cd's, waarvan de grootte varieert van 30 tot 60 nm. De H₂ O₂ -geïnduceerde aggregatie van cd's werd ook onthuld in de genormaliseerde absorptiespectra (aanvullend bestand 1:figuur S3); namelijk, de absorptieband van de cd's verschuift rood van 555 naar 595 nm in het zichtbare gebied [15]. Dienovereenkomstig varieert de kleur van de cd-oplossing van donkerrood tot groen, terwijl de dispersietoestand van cd's verandert in een aggregatietoestand. De XRD-spectra (afb. 1b en aanvullend bestand 1:figuur S4) van de cd's voor en na het toevoegen van H₂ O₂ veranderen weinig, wat aangeeft dat er geen veranderingen zijn in de kristalstructuur van de cd's.

De fluorescentie-evolutie van de voorbereide cd's met de toevoeging van H₂ O₂ werd onderzocht met behulp van fluorescentiespectra. De excitatie-emissiematrices laten zien dat de toevoeging van H₂ O₂ zorgt ervoor dat de emissiecentra van de cd's veranderen van 450 naar 500 nm (Aanvullend bestand 1:Afbeelding S2). De fluorescentievervalcurves getoond in Fig. 2a voor de CD's met de emissie bij 450 en 500 nm kunnen goed worden aangepast door een mono-exponentiële vervalfunctie met een gemiddelde levensduur van respectievelijk 7,96 en 7,12 ns (bij excitatie van 365 nm). Daarentegen is de levensduur van de fluorescentieverval van de cd's na de H₂ O₂ behandeling veranderde in 4,53 en 4,83 ns (Fig. 2b en Tabel 1). Ondertussen is de PL-kwantumopbrengst (η _int ) van cd's veranderde van 5,5 naar 4,6% toen de H₂ O₂ werd toegevoegd in de CD-oplossing. Gezien de verandering van fluorescentielevensduur en PL-kwantumopbrengst, kan worden geconcludeerd dat ladingsoverdracht (CT) kan optreden tussen CD's en H₂ O₂ , wat een trigger zou kunnen zijn om de PL-spectra van de cd's te wijzigen.

een , b Fluorescentieverval van cd's vóór (a ) en na (b ) 0,5 M H₂ . toevoegen O₂ . c , d XPS (N1s) van cd's vóór (c ) en na (d ) 0,5 M H₂ . toevoegen O₂

De FTIR- en XPS-spectra van de CD's werden gemeten om inzicht te krijgen in de chemische samenstelling en veranderingen in de omgeving veroorzaakt door de H₂ O₂ . De FTIR-spectra van cd's voor en na het toevoegen van H₂ O₂ weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S7 illustreert dat de strektrillingen van N–O rond 1350–1390 cm ⁻¹ verhogen met de toevoeging van H₂ O₂ , wat ook wordt bevestigd door het resultaat van de XPS-spectra. Uit de volledige XPS-spectra van het onderzoek (aanvullend bestand 1:figuur S8) blijkt dat de O tot N-verhouding van de cd's voor en na de H₂ O₂ behandeling was respectievelijk 1,57 en 3,85. De toenemende verhouding van O/N onthult dat de bindingstoestanden van N in de CD's kunnen veranderen met de toevoeging van de H₂ O₂ , wat in overeenstemming is met de N1s XPS-spectra met hoge resolutie die worden getoond in Fig. 2c, d. Uit het resultaat van de N1s XPS-spectra is het gehalte aan grafiet N in de cd's verhoogd met de toevoeging van de H₂ O₂ . Verder is er een extra piek van de N–O-toestand bij 407,3 eV in de N1s-spectra na de toevoeging van de H₂ O₂ , wat duidelijk aantoont dat het importeren van de H₂ O₂ zorgt voor de variatie van de oppervlaktetoestanden in de cd's. Uit alle onderzoeken blijkt dat het oppervlak N-frame kan worden gewijzigd door de toevoeging van de H₂ O_2.

Eerdere rapporten suggereren dat de emissiebanden van de CD's gerelateerd zijn aan de oppervlaktetoestanden zoals N-gedoteerde radicalen en ureumgroepen [5, 9, 12, 23,24,25]. Ondertussen zijn deze oppervlaktetoestanden gevoelig voor externe fysieke of chemische stimuli. Op basis van de fotofysische en oppervlakte-omgevingsanalyse stellen we het mechanisme van de fluorescentie-evolutie voor met de introductie van de H₂ O₂ (Afb. 3). De randtoestand van de bereide CD's bestaat uit de geconjugeerde pyrrolische N-groepen. Dit type N-toestand kan meestal gelokaliseerd zijn op een hoog energieniveau. Het geëxciteerde elektron kan dus niet-radiatief ontspannen naar de N-toestand op hoog niveau en vervolgens stralingsoverdracht naar de grondtoestand vergezeld van fluorescentie-emissiebanden rond 450 nm. Daarentegen neemt de fluorescentie-intensiteit van de CD-oplossing enigszins af vanwege de dynamische uitdoving tussen de H₂ O₂ en de cd's, waar de CT ontstaat tussen cd's en H₂ O₂ vergelijkbaar met de eerdere rapporten [26,27,28,29]. Anders zou kunnen worden afgeleid dat de hoogenergetische fluorescentieradicalen (gerelateerde N-toestand) worden omgezet in de N–O-toestand met lagere energie vanwege de impact van het hydroxylradicaal van de H₂ O₂ . Het aangeslagen elektron kan dus meestal ontspannen met een stralingsovergang van de N–O-toestand met lagere energie naar de grondtoestand met een groene emissieband bij 500 nm, wat ook resulteert in de statische uitdoving van 450 nm fluorescentie. Daarom kunnen de belangrijkste emissiebanden van cd's een verandering vertonen van de blauwe emissie naar de groene emissie.

Het mogelijke detectiemechanisme voor cd's voor (links ) en na (rechts ) H₂ . toevoegen O₂

Evaluatie van de CD's Nanosensoren

Op basis van het bovenstaande fluorescerende en colorimetrische gedrag van de cd's hebben we een nanosensor ontwikkeld om H₂ te detecteren O₂ door de cd's. Het voorgestelde detectiesysteem bestaat uit cd's met de juiste concentratie in een waterige oplossing (3,75 μg mL ⁻¹ , Aanvullend bestand 1:Afbeelding S9), waarbij de cd's een dubbele functie hebben als zowel colorimetrische als fluorometrische verslaggevers in dit systeem.

Het voorgestelde nanodetectiesysteem op basis van de CD-oplossing wordt geïllustreerd in Fig. 4. De fluorometrische en colorimetrische verandering veroorzaakt door H₂ O₂ kan duidelijk worden gevisualiseerd met het blote oog (Fig. 4c, f), waar een reeks merkbare kleurveranderingen van blauw naar groen en van donkerrood naar groen kan worden waargenomen onder UV-licht en daglicht. Trouwens, de toevoeging van H₂ O₂ in de CD-oplossing kan ook kwantitatief worden uitgedrukt met de fluorescentie- en absorptiespectra (Fig. 4a, d). Zoals weergegeven in figuur 4a, neemt de fluorescentieband gecentreerd op 450 en 500 nm geleidelijk af met de toename van de H₂ O₂ concentratie van 0 naar 2 M. Echter, de toename van de H₂ O₂ concentratie leidt tot de verschillende afname van de fluorescentie-intensiteit bij 450 nm (I ₄₅₀ ) en 500 nm (I ₅₀₀ ), wat goed overeenkomt met de fluorescentiekleurverandering in de CD-oplossing (figuur 4c). Daarom wordt de verhouding van de fluorescentie-intensiteit bij 500 nm tot die bij 450 nm geselecteerd om de H₂ te controleren O₂ concentratie (Fig. 4a, b). De lagere verhouding houdt verband met de blauwe emissie, terwijl de groene fluorescentie met het blote oog kan worden waargenomen bij een hogere verhouding van I ₅₀₀ naar ik ₄₅₀ . Het lineaire detectiebereik varieert op deze manier van 0,05 tot 0,5 M met een lineaire correlatie R ² = 0,987. Evenzo vindt de colorimetrische verandering plaats in de CD-oplossing vanwege de inhomogene afname van de absorptieband bij 555 en 595 nm. Zoals weergegeven in Fig. 4d, neemt de absorptie-intensiteit af in het zichtbare gebied, maar de toename van de H₂ O₂ concentratie heeft tot gevolg dat de absorptie rond de 595 nm langzamer afneemt dan rond de 555 nm. Vandaar dat de verhouding van de absorptie bij 595 nm (A ₅₉₅ ) daarop bij 555 nm (A ₅₅₅ ) kan ook worden gebruikt om de H₂ . te meten O₂ concentratie. De verhouding van A ₅₉₅ naar A ₅₅₅ neemt exponentieel toe van 0,05 tot 2 M met een exponentiële correlatie R ² = 0,999, en de colorimetrische verandering correleert goed met de H₂ O₂ concentratiebereik van 0,05 tot 0,25 M met de lineaire detectielimiet (LOD) van 14 mM (aanvullend bestand 1:figuur S11 en tabel S1). De dual-mode nanosensoren hebben een goede gevoeligheid van deze methode die voldoet aan de klinische en medicinale vereisten vanwege de concentratie van H₂ O₂ door de GOD-reactie variërend rond millimolair (~ 10 mM) in plasma [20]. Bovendien hebben de dual-mode nanosensoren een intrinsiek ingebouwde kalibratiereferentie, zodat intensiteitsfluctuaties en andere extern veroorzaakte factoren kunnen worden geëlimineerd, wat bijdraagt ​​aan de bevordering van de testnauwkeurigheid.

een Fluorescentiespectra van cd's in aanwezigheid van verschillende H₂ O₂ concentraties. b Kalibratiecurve van I ₅₀₀ /Ik ₄₅₀ van de cd's versus H₂ O₂ concentratie. Inzetstukken toon het lineaire detectiebereik van I ₅₀₀ /Ik ₄₅₀ van de cd's versus H₂ O₂ concentratie. c Fotografische beelden van de fluorescentie-cd-oplossing onder verschillende concentraties H₂ O₂ . d UV-Vis-spectra van cd's in aanwezigheid van verschillende H₂ O₂ concentraties. e Kalibratiecurve van A ₅₉₅ /A ₅₅₅ van de cd's versus H₂ O₂ concentratie. v Fotografische beelden van de CD-oplossing onder verschillende concentraties H₂ O₂

Om de selectiviteit van de nanosensoren naar H₂ . te evalueren O₂ , werden interferentietests uitgevoerd onder identieke omstandigheden met behulp van enkele veelvoorkomende kationen, zoals Na ⁺ , K ⁺ , NH ⁴⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , en Fe ²⁺ . Zoals getoond in Fig. 5a, b, zijn de fluorometrische en colorimetrische veranderingen van de CD's onderzocht in aanwezigheid van verschillende kationen. In aanwezigheid van Na ⁺ , K ⁺ , NH₄ ⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , en Fe ²⁺ , de fluorescentieverhouding van I ₅₀₀ naar ik ₄₅₀ en de absorptieverhouding van A ₅₉₅ naar A ₅₅₅ verschijnen slechts als een kleine variatie in vergelijking met het blanco monster, wat betekent dat deze kationen weinig interferentie hebben met de detectie van H₂ O₂ . Bovendien hebben we de impact op de CD's ook vergeleken met andere oxidanten, zoals HNO₃ , KClO₃ , FeCl₃ , NaClO, K₂ Cr₂ O₇ , en KMnO₄ (Fig. 5c, d en aanvullend bestand 1:Figuren S12 en S13), en we ontdekten dat de fluorescentiekleur verandert van blauw naar groen met de toevoeging van deze oxidanten behalve K₂ Cr₂ O₇ en KMnO₄ . We kunnen dus de interferentie van K₂ . uitsluiten Cr₂ O₇ en KMnO₄ door de fluorescentieverandering. Bovendien kunnen we de impact van andere oxidanten zoals HNO₃ . gemakkelijk uitsluiten , KClO₃ , FeCl₃ , en NaClO uit het resultaat van de absorptieverhouding van A ₅₉₅ naar A ₅₅₅ . Daarom kunnen de dual-mode nanosensoren die in dit artikel worden gedemonstreerd veelbelovend zijn in de hoge selectiviteit van de bepaling vanwege het synergetische effect van de twee onafhankelijke detectiemethoden [30,31,32,33]. Verder hebben we de responstijd van de fluorometrische verandering gemeten bij de toevoeging van H₂ O₂ en ontdekte dat de fluorescentie afneemt na het injecteren van H₂ O₂ en wordt stabiel gehouden op ongeveer 3,3 s (Extra bestand 1:Afbeelding S14).

een , c Fluorescentieverhouding I ₅₀₀ /Ik ₄₅₀ oplossing met cd's en verschillende interfererende kationen (a ) en oxidanten (c ). b , d Absorptieverhouding A ₅₉₅ /A ₅₅₅ oplossing met cd's en verschillende interfererende kationen (b ) en oxidanten (d )

De levensvatbaarheid van A549-cellen werd onderzocht met behulp van standaard CCK-8-assay voor het bepalen van de cytotoxiciteit van CD's. Zoals weergegeven in figuur 6, vinden we dat een levensvatbaarheid van bijna 80% wordt verkregen door de A549-cellen 48 uur lang met cd's te incuberen, zelfs bij hoge concentraties cd's, zoals 500 μg mL ⁻¹ . Er is berekend dat de 50% remmende concentratie (IC50) van cd's ongeveer 1106 μg mL ⁻¹ is door de GraphPad Prism 5.0, waaruit blijkt dat de cd's een goede biocompatibiliteit en een zeer lage cytotoxiciteit bij hoge concentraties hebben. Bovendien hebben we de analytische prestaties van eerder gerapporteerde nanosensoren vergeleken voor de H₂ O₂ bepaling weergegeven in Aanvullend bestand 1:Tabel S2. De biocompatibiliteit, eenvoud en visualisatie van de detectie zijn vergelijkbaar met of zelfs beter dan de meeste van deze gerapporteerde H₂ O₂ testen. Aangezien de op cd's gebaseerde dual-mode nanosensoren een goede selectiviteit hebben naar H₂ O₂ detectie, de juiste detectielimiet (LOD = 14 mM) in dezelfde volgorde als de bloedglucose en zeer lage cytotoxiciteit bij hoge concentraties cd's, zijn de nanosensoren veelbelovend voor gebruik bij het testen van bloedglucose en andere klinische vereisten.

Cellevensvatbaarheid van A549-cellen na 48 uur incubatie in de verschillende concentraties CD's