Biocompatibiliteit van liposoom-nanodragers in het binnenoor van de rat na intratympanische toediening

Abstract

Liposoom-nanodragers (LPN's) zijn mogelijk de toekomst van binnenoortherapie vanwege hun hoge medicijnlaadcapaciteit en efficiënte opname in het binnenoor na een minimaal invasieve intratympanische toediening. Er ontbreekt echter informatie over de biocompatibiliteit van LPN's in het binnenoor. Het doel van de huidige studie is om de biocompatibiliteit van LPN's in het binnenoor na intratympanische levering te documenteren. LPN's met of zonder gadolinium-tetra-azacyclo-dodecaan-tetra-azijnzuur (Gd-DOTA) werden via transtympanische injectie aan de ratten toegediend. De distributie van de Gd-DOTA-bevattende LPN's in het midden- en binnenoor werd in vivo gevolgd met behulp van MRI. De functie van de midden- en binnenoorbarrières werd geëvalueerd met behulp van gadolinium-versterkte MRI. De auditieve functie werd gemeten met behulp van auditieve hersenstamrespons (ABR). De mogelijke ontstekingsreactie werd onderzocht door glycosaminoglycaan en hyaluronzuursecretie en CD44- en TLR2-expressie in het binnenoor te analyseren. De potentiële apoptose werd geanalyseerd met behulp van terminal transferase (TdT) om de vrije 3'OH-breuken in de DNA-strengen van apoptotische cellen te labelen met TMR-dUTP (TUNEL-kleuring). Als gevolg hiervan kwamen LPN's efficiënt het binnenoor binnen na transtympanische injectie. De transtympanische injectie van LPN's met of zonder Gd-DOTA verstoorde de functie van de midden- en binnenoorbarrières niet en veroorzaakte ook geen gehoorbeschadiging bij ratten. De kritische inflammatoire biologische markers in het binnenoor, waaronder glycosaminoglycaan en hyaluronzuursecretie en CD44- en TLR2-expressie, werden niet beïnvloed door de toediening van LPN's. Er was geen significante celdood geassocieerd met de toediening van LPN's. De transtympanische injectie van LPN's is veilig voor het binnenoor en LPN's kunnen worden toegepast als matrix voor medicijnafgifte in de klinische therapie van perceptief gehoorverlies.

Achtergrond

Liposoom-nanodragers (LPN's) zijn mogelijk de toekomst van binnenoortherapie vanwege hun hoge medicijnlaadcapaciteit en efficiënte opname in het binnenoor na een minimaal invasieve intratympanische toediening [1,2,3,4]. De intratympanische benadering wordt door otologen algemeen aanvaard als een rationele benadering van gerichte toediening van geneesmiddelen, omdat het de onnodige ophoping van therapeutische middelen in niet-doelgerichte regio's vermijdt, wat een eerdere strategie was in de kliniek voor de behandeling van de ziekte van Menière en plotseling perceptief gehoorverlies het gebruik van gentamicine en corticosteroïden. De moleculaire targeting van modeltherapieën in het slakkenhuis werd aangegeven door de intratympanische toediening van specifieke peptide-gefunctionaliseerde LPN's [5]. Bovendien werd de automatische aanhoudende afgifte van LPN's aan het binnenoor via het middenoor bereikt met behulp van een nieuw apparaat dat bestaat uit een osmotische pomp en hoogwaardige polyimideslangen [6]. Als het oudste nanotherapeutische platform in de kliniek waren LPN's veilig bij de behandeling van kanker, infectieziekten, ontstekingen, pijn, enz. [7,8,9]. De biocompatibiliteit van LPN's in het midden- en binnenoor blijft echter onbekend en moet worden opgehelderd voordat ze klinisch kunnen worden toegepast in de otologie.

Het oor bestaat uit uitwendige, midden- en binnenoren (Fig. 1) die na intratympanische levering kunnen worden blootgesteld aan de LPN's. Het middenoor is de primaire plaats die wordt blootgesteld aan de LPN's in hun hoogste concentratie, het binnenoor is de therapeutische plaats en het meest gevoelige orgaan voor gevaarlijke stoffen, en de uitwendige gehoorgang kan geïrriteerd raken door uitstromende middelen uit de middenoorholte. Biologische barrières zijn het eerste afweersysteem, die de biologische beschikbaarheid van de middelen beperken, en bestaan in de huid, het slijmvlies en de perineurale structuren. Het barrièresysteem in het binnenoor speelt een cruciale rol bij het handhaven van de ionische homeostase die essentieel is voor de fysiologische activiteit van het binnenoor. De functionele verandering van deze barrières kan nauwkeurig worden geëvalueerd met behulp van gadolinium-enhanced magnetische resonantie beeldvorming (Gd-MRI). Aantasting van de gehoorfunctie kan nauwkeurig worden gemeten via de auditieve hersenstamrespons (ABR). Daarom dient het oor (inclusief de uitwendige, midden- en binnenoor) zelf als een uitstekend model voor nanotoxicologie [10, 11].

Illustratie van het zoogdieroor. Het zoogdieroor (inclusief mensen en ratten) bestaat uit buiten-, midden- en binnenoren. Het uitwendige oor (OE ) bestaat uit oorschelp en uitwendige gehoorgang (EAC ). Het middenoor (ME ) bestaat uit het trommelvlies (TM ) en de holte die de gehoorbeentjesketen herbergt, inclusief de hamer (Ma ), incus (Inc ) en stijgbeugels. De middenoorholte is een verlenging van de nasopharynx via de buis van Eustachius (ET ) en communiceert met het binnenoor via het ovale venster (OW ) en rond raammembraan (RWM ). Het binnenoor bestaat uit het slakkenhuis en het vestibulaire systeem. Het slakkenhuis is het gehoororgaan en heeft drie kamers, d.w.z. de perilymfatische compartimenten van scala tympani (ST ) en scala vestibuli (SV ), en het endolymfatische compartiment van scala media (SM ). Op de zijwand van SM bevinden zich de stria vascularis (StrV ) en spiraalvormig ligament (SLig ). Aan de onderkant van SM bevinden zich organen van Cortis die binnenste haarcellen bevatten (IHC's ) en buitenste haarcellen (OHC's ), tectoriaal membraan (TM ), en spiraalvormige limbus (Slim ). De spiraalvormige ganglioncellen (SGC's ) een actiepotentiaal afvuren dat overeenkomt met de mechano-elektrische transductie van de haarcellen en alle auditieve input van de hersenen leveren. Het vestibulaire systeem is verantwoordelijk voor het evenwicht en bestaat uit drie halfcirkelvormige kanalen (SCC ) en vestibule. De ampullaire cupula in de SCC detecteren rotatieversnellingen en de macula in de sacculus en utriculus van de vestibule detecteren lineaire versnellingen. CN cochleaire zenuw, SP spiraalvormige prominentie, VN vestibulaire zenuw, VS vas spiralis. (aangepast van Zou J. Focal Drug Delivery in Inner Ear Therapy:in Focal Controlled Drug Delivery. Redacteuren:Domb AJ en Khan W. Springer, Londen, VK. ISBN:978-1-4614-9433-1, 2014; p215- 224)

Hyaluronzuur (hyaluronzuur) is een van nature voorkomend polyanionisch biopolymeer en is een primair bestanddeel van de extracellulaire matrix in het basaalmembraan. Hyaluronzuur is samengesteld uit D-glucuronzuur en N-acetyl-D-glucosamine, die zijn gekoppeld via afwisselende β-1, 4 en β-1, 3 glycosidische bindingen. De accumulatie van hyaluronzuur kan bijdragen aan een verhoogde permeabiliteit en ontsteking van de microcirculatie bij nierischemische reperfusieschade [12]. In ons vorige rapport werd aangetoond dat het ototoxische effect van zilveren nanodeeltjes gecorreleerd is met de accumulatie van hyaluronzuur in het slakkenhuis van de rat [11]. Hyaluronzuur bindt zich aan CD44 en toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) in het weefsel en veroorzaakt biologische reacties [13, 14]. De biologische activiteiten die worden gemedieerd door CD44 bij binding aan hyaluronzuur zijn voornamelijk door interactie met regulerende en adaptermoleculen, zoals SRC-kinasen, Rho GTPasen, VAV2, groeifactorreceptorgebonden eiwit 2-geassocieerd bindend eiwit 1 (GAB1), ankyrine, en ezrin [15,16,17]. CD44 medieert ook het metabolisme van hyaluronzuur door de benaderingen van cellulaire opname en afbraak, naast het rekruteren van T-cellen naar ontstekingsplaatsen en het reguleren van door T-cellen gemedieerde endotheelbeschadiging [18]. Er werd gemeld dat de cytotoxiciteit voor endotheelcellen van het binnenoor door anti-endotheelcel-antilichamen een rol zou kunnen spelen bij het veroorzaken van de stria vascularis-schade bij immuungemedieerde plotselinge sensorineurale doofheid [19]. TLR2-afhankelijke nucleaire factor-KB-activering was naar verluidt betrokken bij niet-typeerbare Haemophilus influenzae-geïnduceerde monocyt chemotactische eiwit 1-upregulatie in de spiraalvormige ligamentfibrocyten van het binnenoor, wat de belangrijkste stap zou kunnen zijn in binnenoordisfunctie secundair aan chronische otitis media [ 20]. Als LPN's leiden tot beschadiging van het binnenoor na toediening van het middenoor, zou de TLR2-gemedieerde signaalroute het belangrijke mechanisme moeten zijn.

We wilden de biocompatibiliteit van LPN's in het binnenoor na transtympanische injectie evalueren. De functies van de biologische barrières in de huid (externe gehoorgang), mucosa (middenoorholte) en binnenoorcompartimenten werden op verschillende tijdstippen gemeten met behulp van Gd-MRI. De auditieve functie werd geëvalueerd met behulp van ABR-meting. Ten slotte werden de mogelijke histopathologische veranderingen geanalyseerd door de ophopingen van glycosaminoglycanen en hyaluronzuur, de expressies van CD44 en TLR2 en DNA-fragmentatie in het slakkenhuis te meten.

Resultaten

LPN's veroorzaakten geen functionele veranderingen in rattenslakkenhuis

In de positieve controlegroep, helder signaal in de perilymfe van cochlea (Coch) en de vestibulaire (Vest) aan beide zijden (L, R) (Fig. 2a, b) die de opname van Gd-DOTA aangeeft. Na transtympanische injecties van zilveren nanodeeltjes (AgNP's) namen de signaalintensiteiten in de perilymfatische compartimenten significant toe, terwijl een extreem intens signaal ook werd gedetecteerd in de huid van de uitwendige gehoorgang, het middenoorslijmvlies, wat wijst op de verhoogde opname van Gd-DOTA geassocieerd met AgNP-toediening ( L in Fig. 2a, b) (Tabel 1). Het evaluatiesysteem werd daarom gevalideerd. Bij het dier dat een transtympanische injectie van LPN + Gd-DOTA ontving, werd een helder signaal gedetecteerd op het oppervlak van de gehoorbeentjesketen, scala vestibuli, scala tympani en vestibule 3 uur na injectie, wat wijst op een duidelijke distributie van LPN in deze regio's (Fig. 2c , D). De signaalintensiteit in de scala vestibuli in de basale bocht was zichtbaar sterker dan die in de scala tympani, wat een efficiënte invoer van LPN door het ovale venster in het huidige dier suggereert [21]. Op 6 uur na injectie werden de signaalintensiteiten tussen de scala vestibuli en scala tympani in de basale bocht vergelijkbaar en het hele slakkenhuis vertoonde een bijna homogeen signaal, maar er waren onbeduidende veranderingen in de vestibule (Fig. 2e, f). Bij dieren die intraveneuze injecties van Gd-DOTA ontvingen na transtympanische injectie van blanco LPN's, vertoonden beide zijden vergelijkbare signaalintensiteiten, behalve dat er sterke signalen waren in het middenoor die transtympanische injectie van blanco LPN's ontvingen die accumulatie van LPN's op het oppervlak van gehoorbeentjesketen vermoeden (Fig. . 2g, h). Het zwarte gat in de gehoorbeentjesketen geeft het holle gebied van de stijgbeugel aan (Fig. 2h). Gelijke signaalintensiteiten aan beide kanten suggereerden dat de transporteigenschap voor Gd-DOTA van de bloed-perilymfe-barrières op beide oren niet veranderde na transtympanische injectie van LPN's (Fig. 2g, h) (Tabel 1).

Gadolinium-versterkte MRI van het binnenoor van de rat na toediening van een liposoom nanocarrier (LPN). Bij alle dieren werden nanomaterialen geïnjecteerd op de mediale wand van de linker middenoorholte. De positieve controle werd afgebeeld bij ratten 2 uur na intraveneuze injectie van Gd-DOTA secundair aan transtympanische injectie van zilveren nanodeeltjes (AgNP's) 5 uur van tevoren (a , b ). Dynamische verdeling van LPN's in het midden- en binnenoor werd getoond in c , d , e , v door transtympanische injectie van Gd-DOTA-bevattend LPN zonder intraveneuze toediening van Gd-DOTA. De impact van lege LPN's op de biologische barrière werd aangetoond door MRI 2 uur na intraveneuze injectie van Gd-DOTA (i.v. Gd-DOTA) bij ratten die 5 uur van tevoren transtympanische injectie van LPN kregen (g , u ). Ben ampullair van het achterste halfcirkelvormige kanaal, Coch cochlea, EES uitwendige oorhuid, L linkeroor, LPN-Mu LPN in het middenoorslijmvlies, LPN-OC LPN op de gehoorbeentjesketen (OC ), ME-Mu , middenoorslijmvlies, R rechteroor, SM scala media , ST scala tympani, SV scala vestibuli, Vest vestibulum, 1H basale hogere draaiing van cochlea, 1L basale onderste winding van cochlea, 2H tweede hogere winding van cochlea, 2L tweede onderste winding van het slakkenhuis. Schaalbalk = 5 mm

Noch LPN + Gd-DOTA noch LPN's veroorzaakten significant gehoorverlies, weergegeven als een ABR-drempelverschuiving die werd gemeten met behulp van klik- en toonstoten op de frequenties van 2, 4, 8, 16 en 32 kHz bij 2, 4 en 7 dagen na toediening, vergeleken met de oren die transtympanische injecties met gedeïoniseerd water kregen (dH₂ O) (Fig. 3).

Impact van transtympanische injectie van liposoom-nanodragers op de gehoorfunctie bij ratten gemeten aan de hand van de auditieve hersenstamrespons. Gehoorverlies werd uitgedrukt als drempelverschuivingen. Er was een onbeduidend verschil tussen de groepen (p> 0,05, eenrichtings-ANOVA). n = 6 in elke groep. H2O transtympanische injectie van gedeïoniseerd water in negatieve controlegroep, LPN lege liposoom nanodrager, LPN + Gd-DOTA Gd-DOTA-bevattende LPN, 2d , 4d , en 7d 2, 4 en 7 dagen na injectie

LPN's induceerden geen ophoping van glycosaminoglycaan in het slakkenhuis van ratten

Hematoxyline- en eosinekleuring vertoonden geen ontstekingsinfiltratie van leukocyten en fibrine in het slakkenhuis van alle geanalyseerde dieren, inclusief de stijgbeugel en het ovale venster waar de LPN's doorheen gaan (Fig. 4). Perjoodzuur Schiff's kleuring toonde het bestaan aan van glycosaminoglycanen in de benige wand, spiraalvormige limbus, spiraalvormige ligament, tectoriaal membraan, Reissner's membraan, benige spiraalvormige lamina en stria vascularis in het slakkenhuis van dieren die transtympanische injecties van dH2 O. Er was een gradiënttoename in de signaalintensiteit van de basale bocht naar de apex, en het verschil was significant in de stria vascularis (figuren 5 en 6). De signaalgradiënt in het slakkenhuis was niet veranderd bij de dieren die transtympanische injectie van LPN's en LPN + Gd-DOTA kregen (Fig. 5 en 6).

Hematoxyline-eosinekleuring van rattenslakkenhuis blootgesteld aan liposoom-nanodragers. Er was geen ontstekingsinfiltratie in de cochlea die LPN toegediend kreeg (a ), LPN+Gd (b ), en H2O (c ). Omcirkeld gebied aangegeven selectie van interessegebied voor intensiteitsmetingen (a ). LPN lege liposoom nanodrager, LPN + Gd Gd-DOTA-bevattende LPN. Za saccule, SFP stapes voetplaat, SVJ stapediovestibulaire gewricht, SM scala media, ST scala tympani, SV scala vestibuli, Ut utriculus. Schaalbalk = 1 mm

De secretie van glycosaminoglycaan in het slakkenhuis van de rat blootgesteld aan liposoom-nanodragers werd gedetecteerd met behulp van perjoodzuur Schiff's kleuringslichtmicroscopie. De spiraalvormige limbus (SLim ) en benige wand (BW ) van het slakkenhuis vertoonde de meest intensieve kleuring in groepen met negatieve controle (H2O ) (een –c ), lege liposoom nanodrager (LPN) (d –f ), en Gd-DOTA-bevattende LPN (LPN + Gd ) (g –ik ). Het kleurgebied met zichtbaar hogere intensiteiten werd aangegeven met * in c , v , en h in vergelijking met de linkerkolom. RM Membraan van Reissner, SGC spiraalvormige ganglioncel, SLig spiraalvormig ligament, StrV stria vascularis, 1e basale draai, 2e tweede beurt. Schaalbalk = 50 μm

Kwantificering van de secretie van glycosaminoglycaan in cochlea van de rat blootgesteld aan liposoom-nanodragers gedetecteerd met behulp van perjoodzuur Schiff's kleuring. n = 3 in elke groep. AU willekeurige eenheid, H2O negatieve controle, LPN lege liposoom nanodrager, LPN + Gd Gd-DOTA-bevattende LPN, SLig spiraal ligament, Slim spiraalvormige limbus, StrV stria vascularis, 1e basale draai, 2e tweede beurt. *p < 0.05, **p < 0,01 (eenrichtings-ANOVA met LSD-test gebruikt als post-hocanalyse)

Er was een kleine impact op de hyaluronzuursecretie in rattenslakkenhuis door LPN's

In het slakkenhuis van ratten die transtympanische injecties van dH2O ontvingen, werd positieve kleuring voor hyaluronzuur voornamelijk gedetecteerd in de spiraalvormige ganglioncellen, basale striale cellen, buitenste sulcuscellen en capillaire endotheelcellen, naast andere cellen (Fig. 7). De signaalintensiteiten in de spiraalvormige fibrocyten van de ligamenten van de basale en tweede windingen waren significant hoger dan die van de apex. Deze verschillen werden onbeduidend in het slakkenhuis van ratten met de toepassing van LPN's en LPN + Gd-DOTA, wat aangeeft dat de secretie van hyaluronzuur door de fibrocyten van het spiraalvormige ligament werd beïnvloed door de LPN-toediening (Fig. 8). LPN + Gd-DOTA verminderde ook de kleuring in de fibrocyten van de spiraalvormige ligamenten van de basale bocht. Er was echter geen invloed op de secretie van hyaluronzuur in de meeste cochleaire cellen door de transtympanische injectie van LPN's en LPN + Gd-DOTA (Fig. 7 en 8).

De secretie van hyaluronzuur in het slakkenhuis van de rat, blootgesteld aan liposoom-nanodragers, werd gedetecteerd met immunofluorescente confocale microscopie. Positieve kleuring werd gevonden in de stria basale cel (SBC ), buitenste sulcuscel (OSC ), spiraalvormige ganglioncel (SGC ), en capillaire endotheelcel (CEC ) van modiolus van groepen van negatieve controle (H2O ) (een –c , j ), lege liposoom nanodragers (LPN ) (d –f , k ), en Gd-DOTA-bevattende LPN (LPN + Gd ) (g –ik , ik ). Er was geen kleuring in de antilichaam weggelaten negatieve controle (AbNC ) (m ). CEC capillaire endotheelcel, ISC binnenste sulcuscel, SBC stria basale cel, SL-I spiraal ligament fibrocyte type I, SLSF spiraal limbus satelliet fibrocyte, SMC stria vascularis marginale cel. Schaalbalk = 16 μm

Kwantificering van de secretie van hyaluronzuur in het slakkenhuis van ratten blootgesteld aan liposoom-nanodragers gedetecteerd met behulp van immunofluorescente confocale microscopie. n = 3 in elke groep. AU willekeurige eenheid, H2O negatieve controle, LPN lege liposoom nanodrager, LPN + Gd Gd-DOTA-bevattende LPN, SBC's stria basale cellen, SGC's spiraalvormige ganglioncellen, SLig , spiraalband, Slim spiraalvormige limbus, 1e basale draai, 2e tweede beurt. **p < 0.01 (vergeleken met de apex), ##p < 0,01 (vergeleken met LPN- en H2O-groepen van de basale bocht) (one-way ANOVA met LSD-test gebruikt als post-hocanalyse)

LPN's hebben de CD44-celpopulatie in het rattenslakkenhuis niet veranderd

In het slakkenhuis blootgesteld aan dH₂ O, de striale intermediaire cellen, strial basale cellen, spiraalvormige fibrocyten, spiraalvormige ganglioncellen, Deiters-cellen in het orgaan van Corti en capillaire endotheelcellen in de modiolus en het spiraalvormige ligament vertoonden intensieve kleuring voor CD44. Er was een onbeduidend verschil in de signaalintensiteiten tussen de cochleaire windingen. De CD44-positieve populatie en expressie-intensiteit werden niet beïnvloed door de transtympanische injectie van LPN + Gd-DOTA of LPN's (Fig. 9 en 10).

CD44-positieve celverdeling in het slakkenhuis van de rat blootgesteld aan liposoom nanodrager aangetoond met behulp van immunofluorescente confocale microscopie. CD44-positieve cellen werden voornamelijk gedetecteerd in de stria basale cel (SBC ), spiraalvormig ligament (SL ), Dieter's cellen (DC ), spiraalvormige ganglioncel (SGC ), en capillaire endotheelcel (CEC ) in de groepen met negatieve controle (H2O ) (een –e ), lege liposoom nanodragers (LPN ) (f –j ), en Gd-DOTA-bevattende LPN (LPN + Gd ) (k –n ). Er was geen kleuring in de antilichaam weggelaten negatieve controle (AbNC ) (o ). IHC binnenste haarcellen, M-CEC capillaire endotheelcel in modiolus, SL-CEC capillaire endotheelcel in spiraalvormig ligament:spiraalvormige ganglioncellen, SL-III spiraal ligament fibrocyte type III, SL-IV spiraal ligament fibrocyte type IV, TM tectoriaal membraan, OHC buitenste haarcellen. Schaalbalk = 16 μm

Kwantificering van het CD44-eiwitniveau in het slakkenhuis van ratten blootgesteld aan liposoom-nanodragers gedetecteerd met behulp van immunofluorescente confocale microscopie. Er was een onbeduidend verschil tussen de groepen (p> 0,05, eenrichtings-ANOVA). n = 3 in elke groep. n = 3 in elke groep. AU willekeurige eenheid, H2O negatieve controle, LPN lege liposoom nanodrager, LPN + Gd Gd-DOTA-bevattende LPN, SBC's stria basale cellen, SGC's spiraalvormige ganglioncellen, SLig spiraalband, 1e basale draai, 2e tweede afslag

LPN's veranderden de TLR2-expressie niet in het rattenslakkenhuis

In het slakkenhuis dat was blootgesteld aan dH2O, vertoonden de basale striale cellen, de fibrocyten van de spiraalvormige ligamenten, de wortelcellen, de spiraalvormige ganglioncellen, de pijlercellen van het orgaan van Corti en de capillaire endotheelcellen in de modiolus intensieve kleuring voor TLR2. Er was een onbeduidend verschil in de signaalintensiteiten tussen de cochleaire windingen. De TLR2-positieve populatie en expressie-intensiteit werden niet beïnvloed door de transtympanische injectie van LPN + Gd-DOTA of LPN's (Fig. 11 en 12).

TLR2-positieve celverdeling in het slakkenhuis van de rat blootgesteld aan liposoom nanodrager aangetoond met behulp van immunofluorescente confocale microscopie. TLR2-positieve cellen werden voornamelijk gedetecteerd in de basale stria-cel (SBC ), spiraalvormig ligament (SL ), wortelcel (RC ), pijlercel (PC ), spiraalvormige ganglioncel (SGC ), en capillaire endotheelcel (CEC ) in de groepen met negatieve controle (H2O ) (een –e ), lege liposoom nanodragers (LPN ) (k –n ), en Gd-DOTA-bevattende LPN (LPN + Gd ) (f –j ). Er was geen kleuring in de antilichaam-weggelaten negatieve controle (AbNC ) (o ). IHC binnenste haarcellen, SL-III spiraal ligament fibrocyte type III, OHC buitenste haarcellen. Schaalbalk = 16 μm

Kwantificering van TLR2-eiwitniveau in cochlea van ratten blootgesteld aan liposoom-nanodragers gedetecteerd met behulp van immunofluorescente confocale microscopie. Er was een onbeduidend verschil tussen de groepen (p> 0,05, eenrichtings-ANOVA). n = 3 in elke groep. AU willekeurige eenheid, H2O negatieve controle, LPN lege liposoom nanodrager, LPN + Gd Gd-DOTA-bevattende LPN, SBC's stria basale cellen, SGC's spiraalvormige ganglioncellen, SLig spiraalband, 1e basale draai, 2e tweede afslag

LPN's veroorzaakten geen celdood in rattenslakkenhuis

Er waren schaarse apoptotische cellen die willekeurig zijn verdeeld in het slakkenhuis van niet-behandelde ratten. Verrassend genoeg waren er overvloedige apoptotische cellen in de voetplaat van de stijgbeugel en de ovale vensternis. Er was geen invloed op de hoeveelheid en het distributiepatroon van apoptotische cellen door de toediening van LPN's en LPN + Gd-DOTA (Fig. 13).

Apoptose in het slakkenhuis van de rat blootgesteld aan liposoom-nanodragers aangetoond met behulp van TUNEL-kleuring confocale microscopie. Apoptotische cellen werden schaars gedetecteerd in de cochleaire cellen van ratten in groepen met negatieve controle (H2O ) (een –c ), lege liposoom nanodragers (LPN ) (f –ik ), en Gd-DOTA-bevattende LPN (LPN + Gd ) (j –ik ). Er waren overvloedige apoptotische cellen in de voetplaat van de stijgbeugel (FP ) en ovale raamnis (EIGEN ) van beide groepen (d , e ). In een positieve controle (PC) werd overvloedige TUNEL-kleuring gedetecteerd in de fibrocyten van het spiraalvormige ligament (SL ), stria basale cellen (SBC ), en stria margina-cellen (SMC ). PP periferieproces van de spiraalvormige ganglioncel (SGC ), OC osteocyt, OSC buitenste sulcuscel, SL-IV type IV van spiraalvormige fibrocyten, SLim spiraalvormige limbus, StrV stria vascularis. Schaalbalk een –ik = 32 μm, m = 16 μm

Discussie

LPN's kwamen efficiënt het binnenoor binnen na transtympanische injectie, aangetoond door MRI met behulp van Gd-DOTA als medicijnmimetica die waren ingekapseld in de LPN's (figuur 2c-f). Hoewel een eerdere studie aantoonde dat het ronde venster het belangrijkste pad was van LPN's om het binnenoor binnen te gaan [6], toonde de huidige waarneming aan dat het ovale vensterpad efficiënter was dan het ronde venster om de LPN's van het middenoor naar het binnenoor te transporteren. oor. Dit resultaat suggereerde dat beide routes belangrijk zijn bij het laden van LPN's in het binnenoor na gerichte toediening van de mediale wand van het middenoor. Met behulp van de meest efficiënte in vivo methode van gadolinium-versterkte binnenoor-MRI om de biologische barrière en frequentiespecifieke ABR te evalueren om de gehoorfunctie te beoordelen, toonde de huidige studie aan dat transtympanische injectie van LPN's en LPN + Gd-DOTA de functie van de binnenoorbarrières en veroorzaakte geen gehoorbeschadiging bij ratten. Door de eerder aangetoonde kritische biologische inflammatoire markers [11, 22] te analyseren, induceerden LPN's en LPN + Gd-DOTA niet de ontstekingsreactie in het slakkenhuis. Hoewel het ronde raammembraan niet werd geëvalueerd, sloot de afwezigheid van ontsteking in de stijgbeugel en het ovale raam een duidelijke ontstekingsreactie in het ronde raammembraan uit, aangezien de huidige studie aantoonde dat de ovale raamroute superieur was aan de ronde raambenadering voor LPN's. /P>

MRI van het binnenoor na de intraveneuze injectie van gadoliniumchelaat is in staat om de oxidatieve stress-gemedieerde verstoring in de bloed-perilymfe- en bloed-endolymfe-barrières te detecteren die wordt veroorzaakt door mitochondriale toxines [23]. Van AgNP's werd gemeld dat ze cellulaire stoornissen veroorzaken door het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de activering van Jun-aminoterminale kinasen (JNK), wat leidt tot de afgifte van cytochroom C in het cytosol en de translocatie van Bax naar de mitochondriën [24] ]. Bij transtympanische injectie kwamen AgNP's het binnenoor binnen en veroorzaakten permeabiliteitsveranderingen in de biologische barrières van het binnenoor van de rat [11, 25]. LPN's kwamen ook het binnenoor van de rat binnen na de transtympanische injectie in een grootte-afhankelijk patroon, en de LPN's met een diameter van 95 nm vertoonden de hoogste werkzaamheid bij het passeren van de midden-binnenoorbarrières [3]. In de huidige studie was de gemiddelde grootte van LPN's 100 tot 115 nm, wat iets groter was dan de meest efficiënte grootte. LPN + Gd-DOTA toonde aan dat deze grootte van LPN's het binnenoor binnendrong, wat in overeenstemming is met het vorige rapport [3]. Het binnendringen van LPN's in het binnenoor veroorzaakte echter geen permeabiliteitsveranderingen in de bloed-perilymfe- en bloed-endolymfe-barrières. Dit resultaat suggereerde dat LPN's veilig zijn voor het binnenoor. ABR-resultaten die wijzen op een normale gehoorfunctie ondersteunden het MRI-resultaat.

There was an association between hyaluronic acid secretion and permeability change and microcirculation inflammation in renal ischemic reperfusion injury [12]. The previous study also showed that AgNPs caused the accumulation of hyaluronic acid in the rat cochlea [11]. CD44 and toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) work as receptors of hyaluronic acid and trigger biological reactions [13, 14]. CD44 also mediates the metabolism of hyaluronic acid through cellular uptake and degradation in addition to recruiting T cells to inflammatory sites and regulating T cell-mediated endothelial injury [18]. In the present study, hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were detected in the rat cochlea. LPN + Gd-DOTA reduced the secretion of hyaluronic acid in the spiral ligament fibrocytes. The expressions of CD44 and TLR2 were not changed after the transtympanic injection of either LPNs or LPN + Gd-DOTA. The total glycosaminoglycan, which contains hyaluronic acid in the cochlea was not affected by the administrations of LPNs and LPN + Gd-DOTA. The impact of LPNs on the hyaluronic acid distribution in rat cochlea did not cause either permeability change or hearing loss, indicating that the modification is unharmful. It was reported that macrophages undergo phenotypic changes dependent on molecular weight of hyaluronan that correspond to either pro-inflammatory response for low molecular weight hyaluronic acid or anti-inflammatory response for high molecular weight hyaluronic acid [26]. The observed minor changes of hyaluronic acid distribution in the cochlea might have high molecular weight and anti-inflammatory function. Therefore, there was no hint of an inflammatory reaction in the rat cochlea.

The observed apoptosis in the stapes footplate cells might be normal biological activity. A balance between survival and apoptosis in the stapes footplate cells was reportedly as necessary to inactivate the otosclerosis [27]. Administration of LPN + Gd-DOTA did not affect apoptosis in the rat stapes.

Conclusions

The present study demonstrated that the transtympanic injection of liposome nanocarriers neither impaired the biological barriers of the inner ear nor caused hearing loss in the rats. The critical inflammatory mechanism was not activated by the administration of liposome nanocarriers, either. The results suggested that transtympanic injection of liposome nanocarrier is safe for the cochlea of rat.

Methods

Materials

Sphingosine (Sph), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), and 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (ammonium salt) [DSPE-PEG-2000] were purchased from Avanti polar lipids (Alabaster, USA). DiI (Vybrant DiI cell-labeling solution, 1 mM in solvent) and N-(6-tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-hosphoethanolamine, triethylammonium salt (TRITC-DHPE) were purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA). Gd-DOTA (DOTAREM) was from Guerbet, Cedex, France. Hepes and EDTA were from Sigma. The purity of the lipids was evaluated using thin-layer chromatography on silicic acid-coated plates (Merck, Darmstadt, Germany) developed with a chloroform/methanol/water mixture (65:25:4, v/v/v). An examination of the plates after iodine staining and, when appropriate, upon UV illumination revealed no impurities. The lipid concentrations were determined gravimetrically with SuperG (Kibron, Espoo, Finland); a high-precision microbalance. The polyvinylpyrrolidone-stabilized AgNPs were supplied by Colorobbia (Firenze, Italy). The AgNPs were dispersed in deionized water (370.7 mM), and scanning electron microscopy showed that the AgNPs are spheroids with a particle size of around 100 nm. Dynamic light scattering (DLS) showed a mean hydrodynamic size of 117 ± 24 nm and a mean zeta potential of −20 ± 9 mV.

In the visualization of nanocarrier uptake in the inner ear and the evaluation of biological barrier function, 5 male Sprague Dawley rats, weighing between 334 and 348 g, were provided by the Biomedicum Helsinki, Laboratory Animal Centre, University of Helsinki, Finland (this is the defined animal center that provides animals for MRI experiments in Biomedicum); in the ABR and histological studies, 18 Sprague Dawley rats, weighing between 300 and 400 g, were provided by the Experimental Animal Unit of the University of Tampere School of Medicine in Finland. Animal assignments in each study were shown in Table 2. All animal experiments were approved by the Ethical Committee of University of Tampere (permission number:ESAVI/3033/04.10.03/2011). Animal care and experimental procedures were conducted in accordance with European legislation. Animals in the Gd-MRI study were anesthetized with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min) for induction and 3% for maintenance via a facemask. Animals for the ABR and histological studies were anesthetized with a mixture of 0.5 mg/kg medetomidine hydrochloride (Domitor^® , Orion, Espoo, Finland) and 75 mg/kg ketamine hydrochloride (Ketalar^® , Pfizer, Helsinki, Finland) via intraperitoneal injection followed by an intramuscular injection of enrofloxacin (Baytril^® vet, Orion, Turku, Finland) at a dose of 10 mg/kg to prevent potential infection. The animal’s eyes were protected by Viscotears® (Novartis Healthcare A/S, Copenhagen, Denmark).

Preparation and Characterization of LPNs with and without Gd

Preparation of Gd-containing LPNs

LPNs of unilamellar vesicles with an apparent hydrodynamic particle diameter (Z _av ) of 110 ± 15 nm that contain Gd-DOTA were prepared according to the previously published method [6]. A concentration of 1 mM Gd-DOTA-containing LPN (LPN + Gd-DOTA) refers to 1 mM liposomes encapsulating 500 mmol/L of Gd-DOTA.

Preparation of Blank LPNs

Blank LPNs of unilamellar vesicles with Z _av of 115 ± 10 nm were prepared according to a previous publication [6].

Administration of LPNs

Under general anesthesia with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min), 50 μl of either LPNs or LPN + Gd-DOTA were injected into the left middle ear cavity through the tympanic membrane penetration under an operating microscope (OPMI1-F, Carl Zeiss, Jena, Germany). The same amount of deionized water (H₂ O) was injected transtympanically in rats that were assigned to the negative group. After the injection, the animals were kept in the lateral position with the injected ear oriented upward for 15 min before further measurements.

Evaluation on Biological Barrier Function Using Gd-MRI

One animal receiving transtympanic injection of LPN + Gd-DOTA was selected to demonstrate distributions of LPN in the inner ear using MRI without contrast agent. Two animals receiving transtympanic injection of blank LPNs were engaged in MRI study for evaluation of the biological barrier function. Two animals receiving transtympanic injection of AgNPs (370.7 mM, 40 μl) were used as positive control. The contralateral ear without any injection was used as negative control in all studies. A 4.7T MR scanner with a bore diameter of 155 mm (PharmaScan, Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany) was utilized. The maximum gradient strength was 300 mT/m with an 80-μs rise time. A gadolinium-tetraazacyclododecane-tetraacetic acid (Gd-DOTA, 500 mM, DOTAREM, Guerbet, Cedex, France) solution was injected into the tail vein (0.725 mM/kg) 2 h before the MRI measurements. The imaging protocol and rapid acquisition with relaxation enhancement (RARE) sequences were applied according to a previous publication [10]. MRI scanning commenced at several time points after the transtympanic injection. The first MRI time of around 5 h was determined by taking the penetration time of liposome nanoparticles from the middle ear to the inner ear as a reference [1, 3, 6]. The final imaging time of 8 d was selected according to the course of potential acute inflammation and the availability of the scanner. ParaVision PV 4.0 (Bruker, MA, USA) software was used for the post-processing and quantification of MR images.

ABR Measurement

The auditory function of animals receiving injections of both blank and Gd-containing LPNs were evaluated using ABR measurements using BioSig32 (Tucker Davis Technologies, FL, USA) in a custom made, soundproof chamber. The ABR thresholds upon click and tone burst stimuli were recorded before and at a certain time point post-administration of LPNs. The first ABR measurement was followed on 2 days post-administration of AgNPs, allowing the animals to recover from the general anesthesia during the injection and to ensure the injected solution to be entirely cleared from the middle ear cavity. The second follow-up time of 4 days post-injection was chosen because it is close to the peak time of potential mitochondrial impairment-induced cell death in the cochlea [22]. The third follow-up time of 7 days is the time point when temporary threshold shifts remained significantly approved in an animal model of mitochondrial toxin-induced hearing loss [28]. The ABR recording procedure followed the previous report [11].

Glycosaminoglycan Staining in Rat Cochlea After Administration of LPNs

Hematoxylin-eosin staining to assess potential inflammatory infiltration and periodic acid Schiff’s staining to evaluate potential glycosaminoglycan accumulation in the cochlea after administration of LPNs were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11] The slices were observed and digital images were acquired under a light microscope (Leica DM2000 microscope equipped with an Olympus DP25 camera) for further analysis.

Immunofluorescence Staining for Hyaluronic Acid and Receptors

Immunofluorescence staining for hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11, 21].

Cell Death Detection

Potential nuclear DNA fragmentation in the cochlea was investigated using terminal transferase (TdT) to label the free 3′OH breaks in the DNA strands of apoptotic cells with TMR-dUTP (TUNEL staining) following the reported procedure [11]. Slices exposed to recombinant DNase I (Fermentas, Vantaa, Finland, 100 U/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mg/ml bovine serum albumin) at 37 °C for 10 min, which induced DNA strand breaks prior to the labeling procedures, were utilized as positive controls. The samples were observed under a confocal microscope.

Confocal Microscopy

The samples were observed under a Nikon inverted microscope (ECLIPSE Ti) combined with an Andor confocal system installed with Andor iQ 2.8 software (Andor Technology, Belfast, UK). The excitation lasers were 488 nm (green excitation) and 568 nm (red excitation) from an Andor laser combiner system, and the corresponding emission filters were 525/50 (Alexa Fluor-488) and 607/45 nm (Cy^TM 3 and TMR Red). DAPI was excited with light at 405 nm generated from a light-emitting diode and was detected using a 450–465 nm filter.

Analysis and Statistics

ImageJ (1.45S, National Institutes of Health, Bethesda, USA) software was used for signal intensity measurements. For light microscopy of periodic acid Schiff’s staining, the region of interests (ROIs) including spiral ligament, spiral limbus, and stria vascularis were selected using freehand selections button. The “measure” function was used to obtain the mean gray scale value of the ROI, which was inversely correlated with the staining intensity. For confocal microscopy of immunofluorescence staining, the ROIs including stria basal cells, spiral ganglion cells, spiral ligament, and spiral limbus were extracted using photoshop CS6 (version 13.0, Adobe Systems Software Ireland Ltd, Dublin, Ireland) program and were imported into ImageJ program. The images were split into individual channel, and the green (corresponded to CD44 and TLR2) and red (corresponded to hyaluronic acid) channels were selected for further quantifications. The “Threshold” was adjusted using the “set” button in the “Image” menu, and “Limit to Threshold” option should be selected and “Direct to” should be defined to the corresponding channel in the “Analyze” menu. Then the gray scale value, which was inversely correlated with the staining intensity, was obtained using the “Measure” function in the same menu.

Statistical analyses were performed using the IBM^® SPSS^® Statistics Version 20 software package (SPSS Inc., Chicago, USA). A one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test were used to compare ABR threshold shifts and signal intensities (grayscale) of staining for glycosaminoglycan and hyaluronic acid secretions, and TLR2 and CD44 staining between the LPN injected-ear and saline injected-ear groups in the different cochlear structures among various turns. Least significant difference (LSD) test was used as post hoc analysis. Higher numbers in the grayscale analysis correlate with lower signal intensities of the staining. p < 0.05 was accepted as statistically significant.

Afkortingen

ABR:: Auditory brainstem response
AgNPs:: Silver nanoparticles
dH₂ O:: Deionized water
GAB1:: Growth factor receptor-bound protein 2-associated-binding protein 1
Gd-DOTA:: Gadolinium-tetra-azacyclo-dodecane-tetra-acetic acid (DOTAREM)
Gd-MRI:: Gadolinium-enhanced magnetic resonance imaging
JNK:: Jun amino-terminal kinases
LPN + Gd-DOTA:: Gd-DOTA-containing LPNs
LPNs:: Liposome nanocarriers
ROI:: Region of interests
ROS:: Reactive oxygen species
TLR:: Toll-like receptor

Multi-Layer SnSe Nanoflake Field-Effect Transistors met Au Ohmic-contacten met lage weerstand Eenstaps elektrospinning-route van SrTiO3-gemodificeerde Rutiel TiO2nanovezels en zijn fotokatalytische eigenschappen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal