Ontwikkeling van elektrospun chitosan-polyethyleenoxide/fibrinogeen biocomposiet voor potentiële wondgenezingstoepassingen

Resultaten en discussie

Het is aangetoond dat de combinatie van verschillende polymeren de eigenschappen van het resulterende composiet aanzienlijk verbetert [29, 30]. Combinatiesystemen van polymeer zorgen voor een effectieve modulatie van de sterkte, flexibiliteit, biologische afbraak en kinetiek van geneesmiddelafgifte, die belangrijke parameters zijn voor toepassingen van wondverband. De creatie van unieke composieten kan echter worden beperkt door intrinsieke chemische interacties tussen de samenstellende polymeren. Er werd bijvoorbeeld waargenomen dat zich een polymeerprecipitaat vormde bij het mengen van negatief geladen Fb en positief geladen CS; deze waarneming is goed gedocumenteerd voor moleculen met sterke elektrostatische interacties onder verschillende oplosmiddelomstandigheden [31,32,33]. Bijgevolg vereiste de fabricage van een CS-Fb-polymeercomposietsteiger het gebruik van een dubbele extrusie-elektrospintechniek, zoals eerder beschreven [34].

Morfologie van CS-PEO/Fb-nanovezels

De gemiddelde vezeldiameters voor CS-PEO-, CS-PEO/Fb- en Fb-steigers waren respectievelijk 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113,2 en 351,1 ± 101,7 nm (Fig. 2). Interessant is dat CS-PEO / Fb-composietsteigers dunnere nanovezels vertoonden dan de CS-PEO- of Fb-steigers. De afname van de vezeldiameter kan te wijten zijn aan extra elektrostatische krachten die worden gegenereerd door gelijktijdig geladen polymeerstralen [35,36,37]. De afstoting van de polymeerstralen van elkaar af, veroorzaakt door deze krachten, zou daarom zowel de afstand tussen de spindoppen als de depositietijd kunnen vergroten. De resulterende langere depositietijd correleert met verhoogde buiginstabiliteiten waarvan bekend is dat ze vezelverlenging en dunnere vezelvorming veroorzaken.

Representatieve FESEM-microfoto's van elektrospun-steigers. een CS-PEO, gemiddelde diameter 269,9 ± 68,4 nm. b CS-PEO/Fb, gemiddelde diameter 202,3 ± 113,2 nm. c Fb, gemiddelde diameter 351.1 ± 101,7 nm (n = 100)

Karakterisatie van oppervlaktechemie via ToF-SIMS en watercontacthoek

De ToF-SIMS-spectra van CS-, Fb- en PEO-steigers worden getoond in Fig. 3. Normaal gesproken kunnen unieke chemische vingerafdruksoorten worden gebruikt om individuele polymeercomponenten te onderscheiden. Vanwege de chemische overeenkomsten tussen CS en Fb was er echter een aantal stikstofhoudende soorten (C₃ H₆ NEE ⁺ , CH₄ N ⁺ , CN ⁻ , en CNO ⁻ ) aanwezig in beide spectra, waardoor het moeilijk is om de polymeren van elkaar te onderscheiden. Toen Fb echter in de steiger werd opgenomen, was het totale aantal CN ⁻ en CNO ⁻ soorten namen toe, terwijl de andere fragmenten onveranderd bleven of afnamen. Daarom onderzoeken we de wijzigingen in CN ⁻ en CNO ⁻ fragmentintensiteiten maakten de indirecte detectie van Fb mogelijk. Evenzo is de toename van C₂ H₅ O ⁺ (45 m/z) ionen werden gebruikt om de ethyleenoxidefragmenten van het PEO in de composietsteigers te identificeren.

Vertegenwoordiger a positief en b negatieve ionen ToF-SIMS-spectra voor ongerepte CS (boven), Fb (midden) en PEO (onder). Omcirkelde ionenfragmenten werden gebruikt als de unieke vingerafdruk om de verbinding te identificeren

Om de aanwezigheid en distributie van Fb-componenten binnen de composietsteigers op te helderen, CNO ⁻ en CN ⁻ ionen werden in kaart gebracht over een raster van 50 ×  50 μm van de ongerepte en samengestelde steigers om warmtekaarten te verkrijgen (Fig. 4a, b). Dezelfde mappingtechniek werd uitgevoerd op C₂ H₅ O ⁺ om de PEO-verdeling te bepalen (Fig. 4c). Verhoogde warmtekaartintensiteit was gecorreleerd met een hoger polymeergehalte van Fb of PEO. We hebben vastgesteld dat de intensiteiten van CNO ⁻ , CN ⁻ , en C₂ H₅ O ⁺ waren uniform verdeeld over het 50  ×  50-μm rastergebied van de composietsteigers. Vanwege de dikte van de steigers (93,8 ± 7,4 m) en laag-voor-laag vezelafzetting, wordt verwacht dat de oppervlaktesamenstelling representatief is voor de hele steiger. Daarom suggereren de ToF-SIM-gegevens dat wanneer CS-PEO/Fb-nanovezelsteigers worden gefabriceerd met behulp van elektrospinning met dubbele spindop, individuele componenten uniform door de composietsteiger worden gedeponeerd.

ToF-SIMS-toewijzing van a CNO ⁻ , b CN ⁻ , en c C₂ H₅ O ⁺ ionenfragmenten op verschillende steigers over een rastergebied van 50 × 50-μm

De watercontacthoeken van elektrospun CS-PEO, CS-PEO/Fb en Fb vezelige steigers waren respectievelijk 44,2° ± 5,1°, 61,4° ± 7,6° en 115,7° ± 16,2° (Fig. 5). Op basis van de watercontacthoeken waren CS-PEO- en CS-PEO/Fb-steigers hydrofiel (>-90°), terwijl Fb-steigers hydrofoob waren (<-90°). Watercontacthoeken van CS-PEO/Fb-composietsteigers vertoonden oppervlaktekenmerken die tussen die van de componenten lagen, wat suggereert dat CS-PEO en Fb homogeen werden afgezet tijdens de fabricage. Oppervlakte-eigenschappen van polymere oppervlakken spelen een belangrijke rol bij de afzetting van eiwitten en adhesiefactoren. In het bijzonder is bekend dat belangrijke bacteriële adhesiefactoren gemakkelijker voorkomen op hydrofobe oppervlakken, die bacteriële kolonisatie bevorderen [38]. Als zodanig kan de hydrofiele aard van de CS-PEO/Fb gunstig zijn bij het afschrikken van bacteriële hechting.

Gedrag van gedeïoniseerd water op het oppervlak van een glassubstraat, CS-PEO, CS-PEO/Fb en Fb steigers

Mechanische uniaxiale treksterkte van CS-PEO/Fb-steigers

Uniaxiale trekproeven werden uitgevoerd op nanovezelige steigers met een gemiddelde dikte van 93,8 ± 7,4 m. Een samenvatting van de resultaten wordt getoond in Tabel 1 en overeenkomstige spanning-rekcurves worden getoond in Fig. 6. Over het algemeen zijn mechanische eigenschappen van composietmaterialen gecorreleerd met het zwakste bestanddeel ervan. De resultaten suggereren dat Fb-only scaffolds geen ideale mechanische eigenschappen zouden hebben voor wondverbandtoepassingen. Dit benadrukt het belang van het opnemen van CS-PEO om een ​​mechanisch stabieler product te verkrijgen.

Stress-rekcurves van CS-PEO-, CS-PEO/Fb- en Fb-steigers. Gegevens zijn representatief voor tien onafhankelijk geproduceerde steigers

Waterdampoverdrachtssnelheid van CS-PEO/Fb-steigers

WVTR speelt een cruciale rol bij het handhaven van een ideale vochtigheid van de wondomgeving, wat een positieve invloed heeft op cellulaire granulatie en epithelisatie [39, 40]. Hogere WVTR-waarden correleren met snelle wonddehydratie als gevolg van verdamping en exsudatie, wat de lichaamstemperatuur nadelig kan verlagen en het metabolisme kan verhogen. Omgekeerd correleren extreem lage WVTR-waarden met ophoping van exsudaat, remming van genezing en verhoogd risico op infectie. Lamke et al. rapporteerde de WVTR voor een normale huid als 204 ± 12 g m ⁻² dag ⁻¹ en tussen 279 en 5138 g m ⁻² dag ⁻¹ voor beschadigde huid, afhankelijk van de toestand van de wond [41, 42]. Voor wondepithelialisatie en verbetering van de genezing, een ideale WVTR van 2028,3 ± 237,8 g m ⁻² dag ⁻¹ is gemeld [43]. WVTR's van CS-PEO- en Fb-steigers waren 693,2 ± 95,7 en 686,1 ± 44,17 g m ⁻² dag ⁻¹ , respectievelijk. Hoewel dichter bij de ideale WVTR dan de ongerepte steigers, CS-PEO/Fb-steigers (806.5 ± 56,1 g m ⁻² dag ⁻¹ ) viel nog steeds onder de ideale WVTR (Fig. 7). Manipulaties van de fysieke parameters van de steiger zouden WVTR's kunnen verbeteren om gerapporteerde ideale tarieven beter na te bootsen.

Waterdampoverdrachtssnelheden van de electrospun CS-PEO, CS-PEO/Fb en Fb steigers. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (n = 6, *p < 0,05 in vergelijking met CS-PEO/Fb-steigers)

In vitro cellulaire levensvatbaarheid van menselijke dermale fibroblasten

Chitosan-PEO/Fb-steigers vertoonden gedurende de eerste 48 uur geen significant proliferatief effect op menselijke fibroblasten (Fig. 8); toch produceerde langdurige blootstelling na 72 uur een statistisch significante vermindering van de proliferatie in vergelijking met de controle zonder scaffold. De resultaten suggereren dat er sprake is van remming van cellulaire proliferatie die wordt vertoond door de scaffold, die in de loop van de tijd cumulatief kan zijn.

Vergelijking van proliferatie van menselijke dermale fibroblasten bij blootstelling aan Fb en CS-PEO/Fb electrospun scaffold (n = 9, *p < 0.05 vergelijking gemaakt met "geen steigercontrole" op elk tijdstip)

Het verminderde proliferatieve vermogen kan te wijten zijn aan de mate van acetylering (DA) geassocieerd met CS, waarvan is aangetoond dat het sterke cellulaire interacties heeft door zijn positieve ladingen [44]. Younes et al. toonden aan dat blaascarcinoomcellen behandeld met CS (> 50% DA) de levensvatbaarheid significant verminderden na 24 uur, wat suggereert dat CS-cytotoxiciteit direct gerelateerd is aan zijn DA, wat de proliferatie kan beïnvloeden [45]. Dit effect kan ook worden geïsoleerd in in vitro experimentele omstandigheden; eerdere studies hebben aangetoond dat CS in vivo niet-toxisch is, omdat de biologische afbraakproducten ervan via metabole routes kunnen worden geklaard [46]. Resterend HFIP van het elektrospinproces kan ook bijdragen aan de waargenomen cytotoxiciteit. Dezelfde cytotoxiciteit werd echter niet waargenomen in de elektrospun pure Fb-steiger, die ook in HFIP was bereid. HFIP werd tijdens het fabricageproces waarschijnlijk geëlimineerd uit elektrospun-steigers vanwege de hoge vluchtigheid. Een waarneembare afname van de levensvatbaarheid van de cellen zou duidelijk zijn als resterend HFIP dat in het vezelsysteem was opgenomen, zou vrijkomen tijdens tijdelijke blootstelling aan menselijke dermale fibroblasten.

LIVE/DEAD-assay en mobiele bijlage

Afbeelding 9a-c toont de distributie en levensvatbaarheid van dermale fibroblasten die zijn gezaaid op het oppervlak van met fibronectine gecoat glas, onbelaste CS-PEO/Fb-steigers en met PDGF geladen (4 μg/mL) CS-PEO/Fb-steigers. Na 24 uur in cultuur werden minimale dode cellen waargenomen in vergelijking met de levende cellen. Er werden geen waarneembare verschillen opgemerkt tussen met PDGF geladen en geloste steigers.

Confocal micrographs of fibroblasts seeded on a , d fibronectin-coated glass; b , e unloaded CS-PEO/Fb scaffold; en c , v PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.