Waterstofperoxidedetectie op basis van binnenoppervlakken modificatie van vaste-stof nanoporiën

Resultaten en discussie

Immobilisatie van Nanopore met HRP's

De geselecteerde nanoporie met een diameter van ~ 50 nm werd gedurende 30 minuten ondergedompeld in piranha-oplossing bij 80 ° C. Na behandeling met piranha-oplossing kon het binnenoppervlak van nanopore siliciumhydroxylgroepen opnemen. Vervolgens werd de gehele dunne film geactiveerd met (3-Aminopropyl)triethoxysilaan (3-APTES). Als gevolg van de behandeling met 3-APTES wordt de amino (-NH₂ ) groepen werden gegenereerd op het oppervlak van de film.

Na activering met (3-Aminopropyl)triethoxysilaan (3-APTES) werd de nanoporiechip in 0,1 M PBS-oplossing van N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) (10 mM) en N-hydroxysuccinimide ( NHS) (20 mM). Daarna werd de nanopore-chip geïntroduceerd in mierikswortelperoxidase (HRP) (10 ng/ml). Volgens eerdere onderzoeksresultaten van onze groep [3], met verschillende zoutconcentraties van 0,1 tot 2 M KCl, pH 7,0, aggregeerde HRP niet. Vanwege de pI waarbij de waarde van mierikswortelperoxidase 4,3 ± 0,2 was, bewezen we ook dat de HRP niet aggregeerde in 0,1 M KCl pH 6,0 en pH 7,0. Het EDC-reagens activeerde de carboxyl (-COOH) groepen van HRP tot een zeer reactief o-acylisoureum-tussenproduct. Verder werd het tussenproduct verder omgezet in een stabielere succinimidylamine-reactieve ester in aanwezigheid van NHS [58]. Resulterend in covalente koppeling van het tussenproduct met de (-NH₂ ) gegenereerd op de binnenoppervlakken van nanoporiën om stabiele amidebindingen te vormen (Fig. 1).

Modificatieproces uitvoeren in een enkel nanoporiekanaal in vaste toestand. een Schematische weergave van de covalente aanhechting van mierikswortelperoxidase (HRP) aan een enkel nanoporiekanaal via carbodiimidekoppelingschemie. De carboxyl (-COOH) groepen van HRP werden geactiveerd door EDC-oplossing, waardoor het HRP kon reageren met (-NH₂ ) gegenereerd op het oppervlak van een nanoporie-chip. b Schema van de geïmmobiliseerde HRP's waterstofperoxidesensor, het binnenoppervlak van de sensor werd gemodificeerd met HRP's. Wanneer H₂ O₂ en ABTS plaatsvond, de ABTS ^•+ geproduceerd. De kristalstructuur van HRP is gebruikt met toestemming van auteur [3]

Deze processen leiden ons naar de immobilisatie van HRP's op het binnenoppervlak van een enkele nanoporie. De realisatie van het functionaliseringsproces werd bevestigd door het meten van de stroom-spanning (I-V ) van een enkele nanoporie voor en na modificatie (Fig. 2).

Uitvoeren van een typische stroom-spanning (I-V ) krommen van de ongemodificeerde (originele) en gemodificeerde nanoporie in 0,1 M KCl, gebufferd bij pH 7,0 met 0,1 M PBS. De zwarte lijn is de I-V krommen van ongewijzigde nanoporiën, en rode lijn is de I-V krommen van gemodificeerde nanoporiën met HRP's. De invoegingen zijn de scanning elektronenmicroscopie (SEM) van een enkele nanoporie (diameter van ~ 50 nm cis) en de nanopore sensor. 100 nm is schaal

Karakterisatie van HRP's gemodificeerde solid-state nanopore

Hier de vorm van een enkele Si₃ N₄ nanoporiekanaal is cilindrisch. Afbeelding 2 toont de typische stroom-spanning (I-V ) krommen van de ongemodificeerde (originele) en gemodificeerde nanoporie in 0,1 M KCl, gebufferd bij pH 7,0 met 0,1 M PBS. Na modificatie van het binnenoppervlak van nanoporie met HRP-enzymen, werd de poriegrootte kleiner.

Volgens Wanunu et al, door rekening te houden met de externe geleidbaarheid van nanoporiën, kan de diameter van nanoporie in vaste toestand worden berekend met de volgende vergelijking,

Waar, d en l zijn de diameter en lengte van de porie,G is open porie geleiding van nanopore, σ is de geleidbaarheid van ionenoplossing.

Rekening houdend met geometrische effecten, kan na de modificatie van nanoporiën in vaste toestand met HRP-enzymen de effectieve grootte worden berekend. De diameter van een enkele nanoporie kan worden berekend op basis van de vergelijking (1). Waar, de waarde van geleiding (G _onaangepast ) is ~15 nS kan worden verkregen via I-V krommen van de ongemodificeerde nanoporie in vaste toestand. De geleidbaarheid (σ ) van ionenoplossing 0,1 M KCl (25°C), gebufferd bij pH 7,0 met 0,1 M PBS is ~1,28 S/m. Daarom is de diameter van niet-gemodificeerde nanoporiën ~ 51 nm, het is vergelijkbaar met de gemeten diameter. Met dezelfde methode wordt de verkregen waarde van conductantie (G _aangepast ) is ~7,5 nS, en de diameter (~34 nm) van gemodificeerde nanoporiën kan worden berekend. Verkleining van de diameter is mogelijk vanwege de volgende twee redenen, ten eerste is het behandelen van het binnenoppervlak van nanopore met (3-aminopropyl)triethoxysilaan (3-APTES), waardoor het oppervlak van nanopore (-NH₂ ) aminogroepen. De tweede reden is dat de hydrodynamische diameter (D _h ) van HRP-enzym ~ 8 nm [3] is, kunnen de geïmmobiliseerde HRP's de diameter van de porie verkleinen. Hier wordt de door HRP's gemodificeerde nanoporie in vaste toestand met een diameter van ~34 nm gebruikt als het waterstofperoxidedetectiekanaal.

Het principe van redoxreactie

De redoxreactie werd uitgevoerd in een enkele gemodificeerde nanoporie, en het volgende gepresenteerde reactieproces komt goed overeen met de voorgestelde redoxreactie [58]. In aanwezigheid van H₂ O₂ (0,5 mM), werden HRP-enzymen geïmmobiliseerd op het binnenoppervlak van nanoporiën onmiddellijk omgezet in verbinding 1. Vervolgens accepteerde verbinding 1 één elektron van het reducerende substraatmolecuul ABTS (1,5 mM) om verbinding 2 te genereren. Vervolgens werd verbinding 2 teruggebracht tot het rustende enzym via één elektronenoverdracht van een ander substraatmolecuul ABTS.

De kationische producten (ABTS ^•+ ) van de redoxreacties werden geaccumuleerd in enkele nanoporiën. De translocatie van geaccumuleerde moleculen uit het nanoporiekanaal zou de geleidbaarheid veranderen (G ), en dus de verandering van de huidige (ΔI _b ) kan worden gevonden.

Detectie van translocatiegebeurtenissen

Experimenten werden uitgevoerd met behulp van mierikswortelperoxidase (HRP) gemodificeerde nanoporiën met gemodificeerde poriediameters (~ 34 nm) in 0,1 M KCl, gebufferd bij pH 7,0 met 0,1 M PBS. 2, 2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonaat (ABTS) (1,5 mM) en waterstofperoxide (H₂ O₂ ) (0,5 mM) werden toegevoegd aan het trans-compartiment van de nanoporie. Na toevoeging van ABTS en H₂ O₂ , werden de experimenten met vooringenomen spanningen van -100 tot -800 mV uitgevoerd en werden ze bemonsterd bij 100 kHz. Er waren geen translocatiegebeurtenissen totdat de spanning steeg tot -400 mV. Figuur 3 toont representatieve ionische stroomsporen van de translocatiegebeurtenis bij verschillende spanningen van -400 tot -800 mV in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. De experimentgegevens van langdurige translocatiegebeurtenissen van verschillende spanningen werden toegevoegd aan het aanvullende materiaal (zie aanvullend bestand 1:figuur S3).

een –e Schematische weergave van de translocatiegebeurtenissen bij verschillende spanningen van -400 tot -800 mV. De frequentie van translocatiegebeurtenissen nam toe wanneer de aangelegde spanning toenam van -400 mV tot -800 mV. v De stroomamplitude neemt lineair toe met de spanning. u Een exponentieel afnemende functie (t _d ~ e ^−v/v0 ) werd gebruikt om de verblijftijd te passen die afhankelijk is van de aangelegde spanningen

De huidige blokkadegebeurtenissen in milliseconden werden waargenomen, uitgevoerd in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Door het reagens H₂ . toe te voegen O₂ en ABTS in het transcompartiment, HRP-enzymen geïmmobiliseerd op het binnenoppervlak van een enkel nanoporiekanaal en er vond een redoxreactie plaats. Overvloed aan ABTS ^•+ moleculen werden geproduceerd, een enkele kleinere molecule ABTS ^•+ worden mogelijk niet gedetecteerd met behulp van onze solid-state nanoporie, vanwege de resolutie van het systeem [3]. Deze moleculen zouden echter aggregeren na hun productie. Daarom is het mogelijk om de ABTS ^•+ . te detecteren moleculen. Hier werden de negatieve spanningen vastgehouden en geaggregeerd ABTS ^•+ moleculen gingen door de nanoporiën. Er was een elektroforetische en eletroosmotische stroom wanneer negatieve spanning werd toegepast. HRP was negatief geladen in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 [3], als resultaat zou een dubbele elektrische laag worden geproduceerd en zou eletroosmose in de richting van de negatieve elektrode zijn. Om deze reden waren elektroforese en eletroosmose in dezelfde richting. De geaggregeerde ABTS ^•+ in het enkele nanoporiekanaal zou transporteren door de nanoporie in vaste toestand, stromen in de richting van de negatieve elektrode.

Statistische analyse van translocatiegebeurtenissen

Aangezien de vooringenomen spanning een sleutelrol speelde bij de translocatie van geaggregeerde ABTS ^•+ , de invloed van huidige blokkades van geaggregeerde ABTS ^•+ passeren van de HRP's gemodificeerde nanoporiën versus toegepaste spanningen werd besproken. De frequentie van optreden van translocatiegebeurtenissen was aanzienlijk verbeterd met de toename van de spanning (figuur 3f). Naarmate de spanning toenam, nam ook de amplitude van de stroom toe. De translocatiegebeurtenissen verdwenen echter geleidelijk wanneer de vooringenomen spanning onder -300 mV werd gehouden, wat suggereerde dat geaggregeerde ABTS ^•+ over HRP's hadden gemodificeerde nanoporiën een drempelspanning van −300 mV nodig. Afbeelding 4 toont histogrammen van de gemiddelde stroomamplitude van translocatiegebeurtenissen gemeten voor geaggregeerde ABTS ^•+ bij verschillende spanningen. Op basis van de aanpascurven worden de piekwaarden van de huidige blokkering (ΔI _b ) zijn 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA bij respectievelijk −400, −500, -600, −700 en −800 mV, is het waarschijnlijk dat de vermindering van stroom wordt veroorzaakt door geaggregeerde ABTS ^•+ molecuul dat met verschillende spanningen door de nanoporie gaat. De waarden van de huidige amplitude werden uitgerust met een polynoomfunctie van de eerste orde, die een helling van -0,706 en een snijpunt van 49,262 produceert. Op basis van de aanpassingscurven zijn de waarden van de verblijfstijd echter 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1.744 ms, 4,0 ± 1.441 ms, bij −400, −500, −600, − 700 en −800 mV. Afbeelding 3h toont een exponentieel afnemende functie (t _d ~ e ^−v/v0 ) werd gebruikt om de verblijftijd te passen die afhankelijk is van de aangelegde spanningen. De histogrammen van de verblijfstijd van translocatiegebeurtenissen zijn toegevoegd aan het aanvullende materiaal (zie aanvullend bestand 1:figuur S4).

De histogrammen van de gemiddelde stroomamplitude van translocatiegebeurtenissen gemeten voor geaggregeerde ABTS ^•+ bij verschillende spanningen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Alle histogrammen waren uitgerust met Gauss-verdeling

De huidige stilstandtijd van blokkade versus gebeurtenissen voor elke geaggregeerde ABTS ^•+ bij verschillende spanningen werden gepast in tweedimensionale spreidingsgrafieken (Fig. 5). Alle verzamelde ABTS ^•+ toon een cluster van gebeurtenissen van −400 tot −800 mV, de belangrijkste gebeurtenisclusters zijn te wijten aan geaggregeerde ABTS ^•+ passeren door de HRP's gemodificeerde nanoporie in vaste toestand.

Tweedimensionale spreidingsgrafieken van huidige blokkering versus verblijftijd van gebeurtenissen voor elke geaggregeerde ABTS ^•+ bij verschillende spanningen. De bijbehorende histogrammen worden rechts en bovenaan geplaatst. Alle histogrammen waren uitgerust met Gauss-verdeling

Bovendien werd de enkele translocatie-gebeurtenis bij elke spanning geanalyseerd en werd de huidige blokkade veroorzaakt door dezelfde grootte en geladen substantie. Er wordt dus aangenomen dat elke translocatie-gebeurtenis werd veroorzaakt door de enkele geaggregeerde ABTS ^•+ . Om de translocatietijd van geaggregeerde ABTS ^•+ . te analyseren in onze experimenten. De huidige blokkadeduur t _d wordt beschouwd als de verblijfstijd van een enkele geaggregeerde ABTS ^•+ van de locatie waar het is geproduceerd tot aan de uitgang van nanoporiën. Hier werd een andere voorwaarde overwogen, er kunnen enkele HRP-enzymen geïmmobiliseerd zijn bij de ingang van nanoporiën, en het zou de redoxreactie kunnen katalyseren. Daarom werden andere experimenten uitgevoerd om te verifiëren dat de redoxreactie plaatsvond aan het binnenoppervlak van een enkele nanoporie in plaats van bij de ingang. Voor de verificatie zijn ongewijzigd door HRP's toegepast en geanalyseerd. Deze nanoporiën werden geactiveerd met 3-APTES. En dezelfde concentratie HRP's (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) en H₂ O₂ (0, 5 mM) werden toegevoegd aan het trans-compartiment van nanopore, de negatieve voorgespannen spanning werd toegepast in 0, 1 M KCl, 0, 1 M PBS, pH 7, 0, vanwege de elektroforesekracht konden HRP's niet door de nanoporie gaan. Door de redoxreactie is de geaggregeerde ABTS ^•+ geproduceerd, maar er zijn geen translocatiegebeurtenissen gevonden. Het is mogelijk dat de geaggregeerde ABTS ^•+ elektrostatisch effect veroorzaken bij HRP's en voorkomen dat de geaggregeerde ABTS ^•+ door de nanoporie gaan.

Afbeelding 6 toont de tweedimensionale spreidingsgrafieken van de verandering van conductantie (ΔG ) versus de verblijftijd van gebeurtenissen voor elke geaggregeerde ABTS ^•+ bij verschillende spanningen. Het kan worden gevonden dat verandering van conductantie (ΔG ) voornamelijk geconcentreerd in 0,8 nS. De vorm van translocatiegebeurtenissen is bijna hetzelfde. De gemiddelde waarde van ΔG is ~0,8 nS bij verschillende spanningen. Er kan worden gespeculeerd dat de volume-uitsluiting van elke geaggregeerde ABTS ^•+ molecuul is bijna hetzelfde. Het is mogelijk dat elektrostatische en sterische effecten van geaggregeerde ABTS ^•+ moleculen kunnen de ionenstroom veranderen. Na de analyse, twee typische vormen van stroomsporen met de positief geladen geaggregeerde ABTS ^•+ translocatie werden waargenomen (Fig. 7). De translocatiegebeurtenissen bij −700 mV als vertegenwoordiger. Het percentage van twee type-gebeurtenissen werd geanalyseerd en het kan worden waargenomen dat het percentage type 1-gebeurtenissen toenam met de toename van de spanning, aan de andere kant, het percentage type 2-gebeurtenissen afnam. Er werd aangenomen dat een hogere spanning de translocatie sneller maakt dan de lagere spanning.

Schematische weergave van tweedimensionale spreidingsdiagrammen van ΔG versus de verblijftijd van gebeurtenissen voor elke geaggregeerde ABTS ^•+ bij verschillende spanningen. De bijbehorende fitcurves werden hierboven gepositioneerd. De invoegen zijn de translocatiegebeurtenissen van verschillende spanningen (van -400 tot -800 mV)

een Schema van twee type translocatiegebeurtenissen bij een spanning van −700 mV. b Het percentage van twee typen gebeurtenissen bij verschillende spanningen (−400, −500, −600, −700, −800 mV)

De huidige blokkadesignalen onthulden de grootte, conformatie en interactie van geaggregeerde ABTS ^•+ passeren door het kanaal met enkele nanoporiën. Voor de verandering in de huidige vorm werd gespeculeerd over het proces van de veranderingen. Voor gebeurtenis 1 hebben stroomsignalen een typisch fluctuatiegedeelte met een diepe intensiteit en een korte verblijftijd. Het is mogelijk dat de geaggregeerde ABTS ^•+ gepasseerd door de nanoporie vanaf de plaats waar het wordt geproduceerd. Wanneer de geaggregeerde ABTS ^•+ gepasseerd door de nanopore, wordt de ionische stroom van nanopore hersteld naar het oorspronkelijke niveau (baseline) (I ₀ ). Voor gebeurtenis 2 hebben de stroomsignalen een fluctuatiegedeelte met een diepe intensiteit en hebben dan een horizontale fase. Deze vorm van signalen kan worden toegeschreven aan de elektrostatische interactie van geaggregeerde ABTS ^•+ met de HRP's aan de uitgang van nanopore, en de stroom werd langzaam hersteld tot de basislijn. Voor een beter begrip van de huidige verandering, moeten we beginnen met de verandering in de geleiding van de open poriën (G _porie ) bij een zoutconcentratie (0,1 M KCl). Zoals besproken in de eerdere studies, een vergelijking van de open poriëngeleiding van een negatief geladen nanoporie met een diameter van d en een lengte van l bij een lage zoutconcentratie kan worden omschreven als

waar μ _K en μ _Cl zijn de elektroforetische motiliteiten van K ⁺ en Cl ⁻ , n _KCl is de getalsdichtheid van K ⁺ en Cl ⁻ , de elementaire lading is e, σ _p is de oppervlakteladingsdichtheid van de nanoporiënoppervlakken. In dit experiment werd de nanoporie in vaste toestand chemisch gemodificeerd en de diameter van de nanoporie veranderd. De oppervlakteladingsdichtheid van het nanoporie-oppervlak (σ _p ) kan niet exact worden verkregen. Daarom is de geleiding met open poriën (G _porie ) werd berekend op basis van vergelijking (1). Op grond van vergelijking (1) is de geleiding met open poriën (G _porie ) is ~7,5 nS. Er wordt gespeculeerd dat de verandering van geleiding kan worden toegeschreven aan twee redenen [15]. De eerste reden is dat de volume-uitsluiting van ionen in nanoporiën werd ingenomen door de geaggregeerde ABTS ^•+ moleculen. Als gevolg hiervan nam de geleidbaarheid van nanoporiën in vaste toestand af (ΔG ^- ). De tweede reden is dat sommige ionen uit de nanoporie werden gehaald door de geaggregeerde ABTS ^•+ moleculen die de geleidbaarheid van nanoporiën in vaste toestand verhoogden. In deze experimenten is de ABTS ^•+ geproduceerd in nanoporiën, en er werden geen ionen gebracht. Daarom is de verandering in de geleidbaarheid van nanoporiën in vaste toestand (ΔG ) werd alleen veroorzaakt door de volume-exclusie. Dus de totale verandering van de conductantie kan worden beschreven als

De afname van de geleidbaarheid van nanoporiën in vaste toestand wordt veroorzaakt door de volume-uitsluiting en kan worden berekend met de volgende vergelijking

waar γ is de deeltjesvormfactor die de oppervlakteverhouding is van hetzelfde bolvormige volume en het deeltje. In dit werk wordt de geaggregeerde ABTS ^•+ molecuul werd vereenvoudigd tot een globaal object, daarom is de waarde van γ is 1 en Λ is de volume-uitsluiting. De geleidbaarheid van bulkoplossing σ is 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25°C).

Voor de volume-uitsluiting (Λ ), kunnen we afleiden uit de translocatiegebeurtenissen van enkele andere moleculen. Voor het aansluiten van de geleidingsverandering (ΔG ) op de fysieke eigenschap van moleculen, kan de wet van Ohm worden toegepast op de volumeverandering van elektrolytoplossing op basis van de nanoporie in vaste toestand [59]. Bij een translocatiegebeurtenis van een molecuul in een cilindrische nanoporie in vaste toestand, nam de stroom onmiddellijk af. Wanneer de weerstand van nanoporiën in vaste toestand de weerstand van het hele circuit is, verandert de geleidbaarheid (ΔG ) kan worden beschreven door de volgende vergelijking

In deze vergelijking, A _p H _eff = V _p is het volume van nanoporie in vaste toestand, f (d _m /D _p , lm/H _eff ) is een correctiefactor (het negeerde het oppervlakteladingseffect), in onze experimenten hebben we de geaggregeerde ABTS ^•+ vereenvoudigd molecuul naar een globaal object; daarom is de correctiefactor 1. De d _m /D _p is de verhouding tussen molecuuldiameter en nanoporiediameter, de lm/H _eff is de verhouding tussen de effectieve lengte van het molecuul en de effectieve lengte van naopore. De uitdrukking (5) kan worden vereenvoudigd als

De gemiddelde waarde van conductantie (G _porie ) is geanalyseerd van translocatiegebeurtenissen. Uit de vergelijking (5), de gemiddelde waarde van volume-uitsluiting (Λ ) bij verschillende spanningen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) kunnen worden verkregen. Inmiddels is de grootte van de gebruikte nanoporie bekend, het volume van de nanoporie (V _p ) is ~90746 nm ³ . Op grond van vergelijking (4) is de waarde van geleidingsverandering (ΔG ^- ) kan worden berekend als ~0,6 nS. De gemiddelde waarde van geleidingsverandering die is verkregen uit de experimenten met translocatiegebeurtenissen bij verschillende spanningen (−400, −500, −600, −700, −800 mV) is ~0,784 nS. Er kan worden vastgesteld dat de berekende waarde dicht bij de experimentele waarde ligt.

In een eerder onderzoek is het gelukt om waterstofperoxidemoleculen met verschillende technologieën te detecteren. Maar het is zeldzaam om waterstofperoxide via nanokanalen te detecteren. Tan et al. [3] gedifferentieerde ongelijksoortige gebeurtenissignalen toen HRP's in nanoporiën werden geregen, waren er ABTS en H₂ O₂ in KCl-oplossing. De verschillende type signalen met HRP's translocatie werden beschouwd als ABTS ^•+ door nanoporiën gaan. Zes typische gebeurtenissen van de translocatie van het product van enzymkatalysesubstraten werden geanalyseerd. Ze speculeerden het waarschijnlijke proces van elk type. Er zijn echter niet genoeg bewijzen om te getuigen. Mubarak Ali et al. have accomplished to detect the redox reaction products inner single conical nanochannels [58]. They found that the cationic radical ABTS ^•+ reduced the ion current in the HRP-nanochannel in a voltage-dependent fashion, consistent with voltage-dependent concentrations of ions in conical nanochannels. The magnitude of the current blockage was correlated with the H₂ O₂ concentration in the solution.