Onderzoek naar de rol van emulsiedruppelgrootte en oppervlakteactieve stof in het op grensvlakinstabiliteit gebaseerde fabricageproces van micellaire nanokristallen

Resultaten en discussie

Wij en anderen hebben onlangs de grensvlakinstabiliteitsmethode geïntroduceerd om nanokristallen in te kapselen om composiet nanodeeltjes te vormen voor biologische toepassingen. We kwamen echter vaak niet-reproduceerbare en soms tegenstrijdige resultaten tegen over de fluorescentie-intensiteit van QD's (QD's werden hier gebruikt als het model van nanokristallen). Dit probleem moet worden aangepakt voor vertaling naar de industrie en de kliniek. Veel factoren (bijv. oplosmiddel, polymeer, temperatuur, grootte van de "microreactor") die tijdens het fabricageproces zijn betrokken, kunnen leiden tot fluorescentieverlies en niet-reproduceerbare resultaten. We hebben de verschillende betrokken factoren onderzocht en hebben vastgesteld dat de grootte van de "microreactor" (emulsiedruppels) in dit opzicht een sleutelfactor is, waarbij het gebruik van oppervlakteactieve stof PVA een nauw verwante factor is. Hieronder beschrijven we voornamelijk de resultaten op de effecten van de druppelgrootte van de emulsie en de oppervlakteactieve stof PVA.

We vergeleken de effecten van twee verschillende emulgeermethoden met sterk verschillende mechanische sterktes, namelijk handmatig schudden (krachtig handmatig schudden van het mengsel) en badsonicatie (sonicatie van het mengsel in een badsonicator). We ontdekten dat beide van deze twee methoden uiteindelijk zouden kunnen leiden tot transparante en homogene dispersies na verdamping van organisch oplosmiddel, wat wijst op succesvolle nanokristal-ingekapselde micelvorming (Fig. 1b, c, onderaan). Omdat transparant en homogeen visueel uiterlijk vaak wordt gebruikt als een eenvoudige en handige indicator van succesvolle micelvorming in het op grensvlakinstabiliteit gebaseerde fabricageproces, werd de potentiële impact van verschillende emulgeermethoden op het micelproduct voorheen over het hoofd gezien. We gebruikten lichtmicroscopie om de grootte van emulsiedruppels te onderzoeken die werden gegenereerd door respectievelijk deze twee verschillende emulsificatiemethoden, en ontdekten dat de handmatige schudmethode leidde tot ~ 25 μm (in diameter) druppeltjes, terwijl de badsonicatiemethode leidde tot ~ 3 μm ( in diameter) degenen (Fig. 1b, c, boven). Ongeveer de grootte van 500 druppeltjes werd gemeten voor elk monster met behulp van lichtmicroscopiebeelden om de gemiddelde grootte en grootteverdeling te verkrijgen. Statistische analyse (Student's t test) laat zien dat het verschil tussen de gemiddelde grootte van druppeltjes gevormd door handmatig schudden (~ 25 m) en die door sonicatie (~ 3 μm) statistisch significant was (P < 0,001). Belangrijk is dat we ook controle-experimenten hebben uitgevoerd om te bevestigen dat deze twee verschillende emulgeermethoden consistent emulsiedruppeltjes produceren in de bovengenoemde twee verschillende groottebereiken:handmatig schudden met verschillende tijdsduren (0,5, 1, 2 en 3 min) resulteerden allemaal in in ~ 25 μm emulsiedruppeltjes (met vergelijkbare grootteverdeling) en badsonicatie met verschillende tijdsduren (0,5, 1 en 2 min) resulteerden allemaal in ~ 3 μm emulsiedruppeltjes (met vergelijkbare grootteverdeling, aanvullend bestand 1:figuur S1) .

Visuele observatie van de emulsiedruppeltjes en de resulterende QD-ingekapselde micellen na verdamping van organisch oplosmiddel. een Er werd geen PVA gebruikt. Er werden weinig tot geen emulsiedruppels gevormd (bovenste afbeelding ); weinig tot geen QD-ingekapselde micellen werden gevormd na verwijdering van organisch oplosmiddel (onderste afbeelding , de inzet toont overeenkomstige fluorescerende afbeelding met behulp van een draagbare UV-lamp om het rood . op te wekken QD-fluorescentie). b Handmatig schudden werd gebruikt om emulsiedruppels te vormen. Er zijn ongeveer 25 m emulsiedruppels gevormd (bovenste afbeelding , de inzet toont het meetresultaat van de druppelgrootte van beeldanalyse van 500 druppels). Bovendien bleek de groottevariatie als gevolg van verschillende schudtijden minimaal te zijn (Fig. S1). Na verwijdering van organisch oplosmiddel werd een transparante en homogene dispersie gevormd, wat wijst op succesvolle vorming van nanokristallen ingekapselde micellen (onderste afbeelding , de inzet toont overeenkomstige fluorescerende afbeelding met behulp van een draagbare UV-lamp om het rood . op te wekken QD-fluorescentie). c Badsonicatie werd gebruikt om emulsiedruppeltjes te vormen. Er werden ongeveer 3 μm emulsiedruppels gevormd (bovenste afbeelding , de inzet toont het meetresultaat van de druppelgrootte van beeldanalyse van 500 druppels). Bovendien bleek de groottevariatie als gevolg van verschillende schudtijden minimaal te zijn (Fig. S1). Na verwijdering van organisch oplosmiddel werd een transparante en homogene dispersie gevormd, wat wijst op succesvolle vorming van nanokristallen ingekapselde micellen (onderste afbeelding , de inzet toont overeenkomstige fluorescerende afbeelding met behulp van een draagbare UV-lamp om het rood . op te wekken QD-fluorescentie). Om de grootte van emulsiedruppels van een bepaald monster te analyseren, werd eerst een lichtmicroscopiebeeld van de emulsiedruppels genomen en vervolgens werden de diameters van ~ 500 druppels gemeten door de gratis software ImageJ om de gemiddelde grootte en grootteverdeling van de emulsiedruppels van het monster

Verder voerden we ook een emulgeringsbehandeling uit in afwezigheid van de oppervlakteactieve stof PVA en ontdekten dat er vrijwel geen emulsiedruppeltjes werden gevormd, te oordelen naar het resultaat van de lichtmicroscopie (Fig. 1a, boven), en vrijwel geen micellen werden met succes gevormd, te oordelen naar de waarneming van bijna volledige fasescheiding (QD-precipitatie) in het eindproduct, dwz het niet vormen van micelproduct (figuur 1a, onder). De resultaten van Fig. 1a suggereerden dat de oppervlakteactieve stof PVA vereist is in het grensvlakinstabiliteitsproces voor succesvolle vorming van emulsiedruppeltjes (als de "microreactoren") en van micellen (als de eindproducten). Dit is niet triviaal omdat het suggereert dat, hoewel PS-PEG ook amfifiel van aard is, de aanwezigheid van PS-PEG alleen (zonder de aanwezigheid van PVA) in het systeem niet de emulsiedruppeltjes kan geven die nodig zijn voor het grensvlakinstabiliteitsproces.

Hoewel de productdispersies transparant en homogeen leken te zijn direct nadat ze waren gevormd (TEM- en DLS-karakteriseringsresultaten toonden bolvormige en monodisperse QD-ingekapselde micellen, aanvullend bestand 2:figuur S2), het verschil in emulsiedruppelgroottes gegeven door de bovenstaande twee verschillende emulgeringsmethoden, namelijk handmatig schudden en sonicatie, bleken te leiden tot grote verschillen in de micellaire nanokristallen producten. We hebben de verandering van de fluorescentie-intensiteit van de micellaire QD's (in QD ingekapselde micellen) gevormd door respectievelijk handmatig schudden en ultrasoonapparaat gedurende een periode van 40 dagen bij 4 ° C gemeten en gevolgd. We ontdekten dat, voor de micellaire, QD's gevormd door handmatig schudden (gedurende 1 minuut, gevormd uit ~ 25 μm emulsiedruppels), hoewel de fluorescentie-intensiteit (gemeten door fluorescentiespectroscopie) werd gehandhaafd tijdens het micelvormingsproces, na verloop van tijd (~ 10 dagen) nam de fluorescentie-intensiteit van de micellaire QD's geleidelijk af tot slechts ongeveer 50% van het oorspronkelijke fluorescentie-intensiteitsniveau en bleef daarna stabiel (figuur 2a). Daarentegen behielden de micellaire QD's gevormd door sonicatie (gedurende 30 s, gevormd uit ~ 3 μm emulsiedruppeltjes) grotendeels de fluorescentie-intensiteit (gemeten door fluorescentiespectroscopie) gedurende de gehele tijdsperiode (figuur 2a). Verder gebruikten we blote ogen om het onderste deel van de micellaire QD-dispersies te observeren, gevormd door respectievelijk handmatig schudden en sonicatie, nadat de monsters 10 dagen bij 4 ° C hadden gestaan. In het onderste deel van de micellaire, QD-dispersies gevormd door handmatig schudden (gedurende 1 min) na 10 dagen opslag, werd zichtbaar neerslag waargenomen met het blote oog (figuur 2a, inzet). Daarentegen werd in het onderste deel van de micellaire QD-dispersies gevormd door sonicatie (gedurende 30 s) na 10 dagen opslag geen zichtbaar precipitaat waargenomen met het blote oog (figuur 2a, inzet). Deze resultaten suggereren dat, hoewel beide emulgeermethoden zouden kunnen leiden tot succesvolle vorming van QD-ingekapselde micellen met vergelijkbare inkapselingsefficiëntie, een groot deel van de QD-ingekapselde micellen gevormd door grotere emulsiedruppeltjes (~ 25 μm, geproduceerd door handmatig schudden gedurende 1 minuut ) was colloïdaal onstabiel en resulteerde na verloop van tijd in precipitatie en dus verlies van fluorescentie uit de dispersie, terwijl alle QD-ingekapselde micellen gevormd door kleinere emulsiedruppeltjes (~ 3 μm, geproduceerd door badsonicatie gedurende 30 s) colloïdaal stabiel waren en dus gehandhaafd fluorescentie gedurende lange tijd (TEM-onderzoek van de dispersie na 10 dagen opslag toonde ook goed onderhouden morfologie van micellaire nanokristallen, zoals weergegeven in aanvullend bestand 3:figuur S3). Bovendien ontdekten we dat, wanneer de sonicatietijd werd verhoogd van 30 s tot 1 en 2 min om emulsiedruppeltjes te vormen, de fluorescentie-intensiteit drastisch werd verminderd, hoewel de QD-ingekapselde micellen gedurende lange tijd colloïdaal stabiel waren voor de verschillende duur van de behandeling met ultrasoonapparaat, te oordelen naar de stabiele fluorescentie-intensiteit gedurende de opslagtijd (Fig. 2b). Het fluorescentieverlies getoond in Fig. 2b werd waarschijnlijk veroorzaakt door het ontstaan ​​van oppervlaktedefecten op QD's door de sterke en langdurige mechanische behandeling. In een controle-experiment bleek de fluorescentie-intensiteit van hydrofobe QD's opgelost in chloroform ook geleidelijk af te nemen onder sonicatiebehandeling met verhoogde sonicatietijd (aanvullend bestand 4:figuur S4), wat deze voorgestelde oorzaak van fluorescentieverlies ondersteunt. Samen onthult Fig. 2a, b de twee belangrijkste mechanismen van fluorescentieverlies in het QD-ingekapselde micelsysteem dat is gefabriceerd door het grensvlakinstabiliteitsproces, namelijk colloïdaal onstabiele QD-ingekapselde micellen en door mechanische behandeling gegenereerde QD-oppervlaktedefecten.

Fluorescentiestabiliteit van QD-ingekapselde micellen vervaardigd door het grensvlakinstabiliteitsproces. een Verandering van fluorescentie-intensiteit (gemeten door fluorescentiespectroscopie) in de loop van de tijd voor QD-ingekapselde micellen, waarbij de emulsiedruppels worden gevormd door ofwel handmatig schudden (gedurende 1 minuut, dwz ~ 25 μm druppeltjes) of sonicatie (gedurende 30 s, dwz ~ 3 m druppels), respectievelijk. De inzet zijn afbeeldingen van de in QD ingekapselde miceldispersies na 10 dagen opslag bij 4 °C met de emulsiedruppeltjes gevormd door ofwel handmatig schudden (gedurende 1 min, dwz ~ 25 μm druppeltjes) of sonicatie (gedurende 30 s, dwz ~ 3 m druppels), respectievelijk. Paneel a geeft aan dat een oorzaak van verlies van fluorescentie van QD-ingekapselde micellen de aanwezigheid van colloïdaal onstabiele QD-ingekapselde micellen is. b Verandering van fluorescentie-intensiteit (gemeten door fluorescentiespectroscopie) in de loop van de tijd voor QD-ingekapselde micellen met de emulsiedruppeltjes gevormd door sonicatie (d.w.z. ~ 3 μm druppeltjes) voor drie verschillende sonicatiebehandelingstijdduren. Paneel b geeft aan dat een oorzaak van het verlies van fluorescentie van QD-ingekapselde micellen QD-oppervlaktedefecten zijn die worden veroorzaakt door een sterke en langdurige mechanische behandeling

Van deze twee mechanismen van fluorescentieverlies, hoewel het algemeen bekend is dat QD-fluorescentieverlies kan worden veroorzaakt door schade aan het QD-oppervlak, was het resultaat dat een deel van de micellen colloïdaal instabiel was een verrassing voor ons. Daarom hebben we verder onderzoek gedaan naar dit specifieke mechanisme. We hebben eerst de vraag gesteld of de bovengenoemde geprecipiteerde QD's inderdaad waren ingekapseld in micellen (of micelachtige assemblagestructuren). We ontdekten dat het simpelweg schudden van de dispersie met deze precipitaten zou kunnen leiden tot terugkeer van de fluorescentie-intensiteit van de dispersie naar het oorspronkelijke niveau (Fig. 3a, links); een controleonderzoek naar het gebruik van dezelfde behandeling voor hydrofobe QD's die in water waren geprecipiteerd, vertoonde daarentegen geen dergelijke toename van de fluorescentie-intensiteit (figuur 3a, rechts). Bovendien toonden transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beelden van het onderste deel van de productmonsters gevormd door handmatig schudden na 10 dagen opslag een groot aantal QD's geclusterd in grote sferische en niet-sferische structuren (Fig. 3b, links); in het onderste deel van de productmonsters gevormd door sonicatie na 10 dagen opslag, toonden de overeenkomstige TEM-afbeeldingen daarentegen slechts een klein aantal QD's geclusterd in een bolvormige structuur (figuur 3b, midden). Deze resultaten laten dus zien dat de geprecipiteerde QD's inderdaad waren ingekapseld in micellen of micelachtige assemblagestructuren, d.w.z. deze QD's waren geen naakte hydrofobe QD's. Vervolgens stelden we de vraag wat de chemische aard is van deze colloïdaal onstabiele micellen (of micelachtige assemblagestructuren). Omdat een PS-PEG-micel colloïdaal stabiel zou moeten zijn, veronderstelden we dat de onstabiele micellen (of micelachtige assemblagestructuren) werden gevormd door de oppervlakteactieve stof PVA. Deze hypothese wordt ondersteund door de volgende twee lijnen van experimenteel bewijs. Ten eerste ontdekten we dat het gebruik van PVA zonder PS-PEG in het grensvlakinstabiliteitsproces inderdaad zou kunnen resulteren in micellen die QD's inkapselen (figuur 3b, rechts). Ten tweede hebben we ter vergelijking dialyse-experimenten uitgevoerd op respectievelijk PS-PEG micellaire QD's en PVA micellaire QD's. Na dialysebehandeling (waarbij de molecuulgewichtsgrens van de dialysezak 200 kD is, wat groter is dan de molecuulgewichten van PVA en PS-PEG) tegen zuiver water, bleven de PS-PEG micellaire QD's colloïdaal stabiel, te oordelen naar het feit dat de QD-fluorescentie bleef homogeen in de dispersie (figuur 3c, links). In schril contrast hiermee leidde de PVA micellaire QD-dispersie tot duidelijk zichtbare fluorescerende aggregaten na bijna identieke dialysebehandeling zoals hierboven (figuur 3c, rechts). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. een Links , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Right , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b Links and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Right , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), respectievelijk. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. een , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ). c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. een PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ). In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)