Microscopie-geïntegreerde spectroscopie: precise UV-Vis-NIR analyse van microschaal monsters

Een hyphenated instrument is een instrument dat de mogelijkheden van twee verschillende technologieën combineert om een nieuwe analytische techniek te vormen met nieuwe mogelijkheden. De microspectrofotometer is zo'n hyphenated instrument; het is een hybride die de vergrotende kracht van een optische microscoop combineert met de analytische vaardigheden van een UV-zichtbaar-NIR bereik spectrofotometer. Als zodanig kunnen microspectrofotometers gebruikt worden om de moleculaire spectra van microscopische monstergebieden te meten van de diepe ultraviolet tot de nabij-infrarood regio. Ze kunnen geconfigureerd worden voor veel verschillende typen spectroscopie en, als zodanig, worden gebruikt om absorbantie, reflectantie, en zelfs emissiespectra te meten, zoals fluorescentie en fotoluminescentie, van micron-grootte monsters. Met de toevoeging van gespecialiseerde algoritmes, kan de microspectrofotometer ook gebruikt worden om de dikte van dunne films te meten of als een colorimeter voor microscopische monsters te fungeren.

Er zijn veel redenen om de microspectrofotometer te gebruiken. De meest voor de hand liggende is dat spectra verkregen kunnen worden van een monstergebied kleiner dan een micron. Bovendien vereisen deze instrumenten slechts kleine hoeveelheden monsters in vaste of vloeibare vorm. Een ander voordeel is dat zeer weinig of geen voorbereiding vereist is voor veel monsters. En kleurvergelijkingen door spectroscopie neigen ertoe nauwkeuriger te zijn met spectrofotometers omdat deze instrumenten een breder spectrale bereik hebben, kunnen corrigeren voor verlichtingsvariaties, en de intensiteit van elke golflengteband van licht kunnen meten.

Voor het avènement van microspectroscopie, was de enigste manier om veel typen microscopische monsters te analyseren het gebruik van micro-chemische testen en dan een of andere visuele inspectie. Helaas neigen deze methoden ertoe destructief te zijn, veel monsters te vereisen, en te lijden onder de onnauwkeurigheden van het menselijke visuele systeem. De microspectrofotometer vermijdt deze problemen en kan "zien" buiten het bereik van het menselijk oog en variaties detecteren die anders niet duidelijk zouden zijn.

Microspectrofotometer Ontwerp

De microspectrofotometer integreert een optische of lichtmicroscoop met een UV-zichtbaar-NIR bereik spectrofotometer (Figuur 1). De microscoop is een apparaat ontworpen om een beeld van kleine objecten te vergroten om ze te laten bestuderen. De spectrofotometer is een instrument dat de intensiteit van elke golflengte van licht meet van het ultraviolet door het zichtbare en nabij-infrarood gebied. Met een correct geconfigureerde microspectrofotometer, is men in staat om absorbantie, reflectantie, en emissiespectra te verkrijgen met steekproefgebieden op de submicron-schaal.

Om zo'n breed spectrale bereik met goede beeld- en spectrale kwaliteit te dekken, wordt een op maat ontworpen microscoop gebouwd en geïntegreerd met de spectrofotometer. Standaard optische microscopen hebben een beperkt spectraal bereik dat slechts een deel van het zichtbare gebied dekt vanwege de materialen die voor de optica gebruikt worden alsook de lichtbronnen zelf. De moderne microspectrofotometer gebruikt een op maat gebouwde microscoop met een optisch ontwerp en lichtbronnen geoptimaliseerd voor de diepe UV tot de NIR.

De spectrofotometer zelf moet ook ontworpen zijn voor microspectroscopie om goede spectrale resultaten te verkrijgen. Dit betekent dat de spectrofotometer hoog gevoelig moet zijn terwijl nog steeds een acceptabele spectrale resolutie behoudt. Stabiliteit is ook een kwestie aangezien de microspectrofotometer een single-beam instrument is en referentiespectra moeten verkregen worden vóór het meten van het monster. Het instrument moet ook een hoge dynamische bereik hebben aangezien men vaak schakelt van transmissie of reflectantie microspectroscopie naar fluorescentie-spectroscopie bij het meten van hetzelfde monster. Dit stelt je in staat om verschillende typen spectrale informatie van precies dezelfde locatie op het microscopische monster te verkrijgen.

Integratie van de spectrofotometer met de microscoop is van cruciaal belang. Terwijl de microscoop en spectrofotometer beide geoptimaliseerd moeten zijn voor microspectroscopie, is de sleutel tot de werking van een microspectrofotometer de hardware die hen in staat stelt om samen te werken. Deze interface heeft verschillende basisvereisten. Het allerbelangrijkste is dat het de elektromagnetische energie die door de microscoop van het monster wordt verzameld, in de spectrofotometer kan leiden. Echter, de gebruiker moet in staat zijn het monstermeetgebied te visualiseren, maar ook de omringende monster te zien. Dit wordt gedaan door de ingangsopening van de spectrofotometer op hetzelfde brandvlak als het monsterbeeld te plaatsen. Het monster kan dan met de microscooptrap verplaatst worden, zoals men normaal met een microscoop zou doen, totdat het beeld van de ingangsopening over het te meten gebied ligt. In Figuur 2 is het zwarte vierkant in het midden van het beeld de ingangsopening van de spectrofotometer. Al dit wordt in real-time gedaan, zodat de spectroscopie van microscoopmonsters snel en gemakkelijk is.

Zoals getoond in Figuur 3, focust de microscoopoptica het licht op het monster. De elektromagnetische energie wordt vervolgens verzameld van het monster door de microscoopobjectief. Het licht van het objectief wordt gefocust op de gespiegelde ingangsopening van de spectrofotometer. Het merendeel van het licht wordt gereflecteerd van het oppervlak van de ingangsopening naar de camera. De spectrofotometeropening wordt ook door de camera geïmaged zodat het als een zwart vierkant op het monster verschijnt (Figuur 2). Dit stelt eenvoudige en snelle afstemming van de microspectrofotometer in. Het licht dat door de ingangsopening passeert, passeert vervolgens in de spectrofotometer waar een spectrum gemeten wordt.

De microscoop kan geconfigureerd worden met verschillende verlichtingsschema's, afhankelijk van het type experiment dat uitgevoerd moet worden. Incidentverlichting met wit licht stelt reflectantie-microspectroscopie in van de diepe UV tot de nabij IR. Incidentverlichting kan ook gebruikt worden voor fluorescentie of fotoluminescentie microspectroscopie. Daarnaast is transmissie-microspectroscopie mogelijk met wit licht gefocust op het monster door de microscoopcondensor.

Toepassingen van Microspectroscopie

De eerste microspectrofotometers werden in de jaren '40 ontwikkeld en sindsdien zijn een heel aantal verschillende toepassingen ontwikkeld. Met de mogelijkheid om spectra van microscopische monstergebieden te verkrijgen, worden microspectrofotometers overal gebruikt, van universiteitslaboratoria tot productielijnen voor kwaliteitscontrole en falenanalyse.

Forensische Wetenschap. De analyse van forensisch bewijs is een van de meest belangrijke toepassingen voor microspectrofotometers sinds de vroege jaren '80. De grootste inspanning was in de analyse van sporenbewijs, specifiek textielvezels en verfschilfers1, 2. Zoals hun namen suggereren, zijn deze typen monsters meestal microscopisch en, als bewijs, mogen ze niet beschadigd of vernietigd worden door testen. Met vezels worden microspectrofotometers gebruikt om de UV-zichtbaar-NIR absorbantie- en fluorescentiespectra van individuele vezels te meten. Verfschilfers worden meestal dwarsdoorsneden en vervolgens wordt het absorbantiespectrum van elke laag gemeten, zodat bekende en bevraagde monsters met een hoge mate van discriminatie vergeleken kunnen worden.

Flat Panel Displays. Moderne flat panel displays bestaan uit miljoenen multi-kleurige pixels. Naarmate de technologie vorderde, worden de pixels steeds kleiner en dichter bij elkaar gepakt over steeds grotere oppervlakken. De modernste displays gebruiken verschillende technologieën, zoals quantum dots en organische licht-emitterende diodes, om pixels van verschillende kleuren op microscopische schaal te creëren. De microspectrofotometer wordt gebruikt om deze materialen te helpen ontwikkelen als levensvatbare lichtbronnen en uiteindelijk als displays 3,4. De microspectrofotometer wordt ook in het productieproces gebruikt om ervoor te zorgen dat zowel de kleur als de intensiteit van de pixels consistent zijn over het hele display, wat zorgt voor heldere en gelijkmatig verlichte beelden over het display.

Energie. Steenkool en petroleum bronrot gesteente bevatten vitrinit en andere maceralen. Microspectrofotometers worden gebruikt om de thermische rijpheid5, en daarmee de energie-inhoud, van steenkool, cokes en petroleum bronrot te bepalen. Dit wordt gedaan door de absolute reflectiviteit van vitrinit op een gepolijst monster te meten. Afhankelijk van de reflectiviteit, kan de thermische rijpheid van het monster bepaald worden.

Nanotechnologie. De microspectrofotometer bevordert ook nanotechnologie en materialenwetenschap gebaseerd op hun vermogen om transmissie, reflectantie, en emissiespectra microscopische monstergebieden te meten. Een snel groeiend toepassingsgebied is de ontwikkeling en het gebruik van oppervlakte-plasmon-resonantie (SPR)6,7,8.

Oppervlakte-plasmonen worden geëxciteerd door een planair metaaloppervlak of nanoschaal metaaldeeltjes te verlichten met licht (Figuur 4). Veranderingen in de optische kenmerken van deze materialen treden op wanneer deze nanopartikels of oppervlakken interacteren met andere materialen. Als zodanig wordt veel werk gedaan om nieuwe materialen te ontwikkelen die een of andere vorm van plasmon-resonantie vertonen, maar ook om apparaten te bouwen die deze fenomenen bevatten. De laatste omvat biosensoren en microfluïdische apparaatsensoren van diverse typen. De microspectrofotometer meet hoe de spectra van de SPR-materialen veranderen onder verschillende omstandigheden, wat de onderzoeker in staat stelt om een nieuw materiaal te karakteriseren, en dan dat materiaal "af te stellen" voor specifieke optische effecten.

Conclusie

De microspectrofotometer is een hyphenated techniek die de optische microscoop combineert met een spectrofotometer zodat men spectra van microscopische monstergebieden kan verkrijgen. Zulke instrumenten zijn in staat absorbantie- en reflectantiespectra van de diepe UV door het zichtbare en in de nabij-infrarood regio's. De microspectrofotometer kan ook fluorescentie en andere typen emissiespectra meten. Deze apparaten hebben toepassingen gevonden in veel velden, inclusief forensische wetenschap, halfgeleider- en optische filmdiktemeting, biotechnologie, en de nieuwste in materialenwetenschap.

Referenties

1. S. Walbridge-Jones, Microspectrophotometry for textile fiber color measurement, Identification of Textile Fibers, Woodhead Publishing, 2009, Pages 165-180,
2. Standard Guide for Microspectrophotometry in Forensic Paint Analysis, American Society of Testing and Materials.
3. Buchnev, O., Podoliak, N., & Fedotov, V. A. (2018). Liquid crystal-filled meta-pixel with switchable asymmetric reflectance and transmittance. J. Molecular Liquids, 267, 411-414.
4. Rezaei, S. D., Hong Ng , R. J., Dong, Z., Ho, J., Koay, E. H., Ramakrishna, S., & Yang, J. K. (2019). Wide-gamut plasmonic color palettes with constant subwavelength resolution. ACS nano, 13 (3), 3580-3588.
5. "Methods for the petrographic analysis of coals – Part 5: Method of determining microscopically the reflectance of vitrinit", ISO 7404-5, International Organization for Standardization, 2009.
6. Ng, R.J.H., Krishnan, R.V., Dong, Z., Ho, J., Liu, H., Ruan, Q., Pey, K.L. and Yang, J.K (2019). Micro-tags for art: covert visible and infrared images using gap plasmons in native aluminum oxide. Optical Materials Express, 9 (2), 788-801.
7. Alali, M., Yu, Y., Xu, K., Ng, R.J., Dong, Z., Wang, L., Dinachali, S.S., Hong, M. and Yang, J.K. (2016). Stacking of colors in exfoliable plasmonic superlattices. Nanoscale, 8 (42), 18228-18234.
8. Jiang, M., Siew, S.Y., Chan, J.Y., Deng, J., Wu, Q.Y.S., Jin, L., Yang, J.K., Teng, J., Danner, A. and Qiu, C.W., (2020). Patterned resist on flat silver achieving saturated plasmonic colors with sub-20-nm spectral linewidth. Materials Today, 35, 99-105.

Dit artikel is geschreven door Dr. Paul Martin, President, CRAIC Technologies (San Dimas, CA). Voor meer informatie, contacteer Dr. Martin op Dit e-mailadres wordt beveiligd tegen spambots. U heeft JavaScript nodig om het te kunnen zien., of bezoek hier .