Biocompatibele chitosan-nanobellen voor door echografie gemedieerde gerichte toediening van doxorubicine

Materialen en methoden

Materialen

De NB's die in deze studie worden beschreven, zijn geconstrueerd met behulp van perfluorpropaan (C3F8, R&D Center for Specialty Gases aan het Research Institute of Physical and Chemical Engineering of Nuclear Industry, Beijing, China) als de kern en een chitosan-coating als de schaal. Daarnaast Epikuron 200 (sojalecithine met 95% dipalmitoylfosfatidylcholine, Lukas Meyer, Hamburg, Duitsland), ethanol (analytische kwaliteit, Hushi, China), doxorubicinehydrochloride (Sigma-Aldrich, Missouri, VS), chitosan (100~300 kD , Bozhihuili, Qingdao, China) en palmitinezuur (JINDU, Shanghai, China) werden ook in deze studie gebruikt. Pluronic F68 werd gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS).

Mobiele lijn

MCF-7 humane borstcarcinoomcellijn werd verkregen van de American Type Culture Collection (Rockville, MD, VS) en gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) (Gibco, Carlsbad , CA, VS). De cellen werden gekweekt onder 37°C, 5% CO₂ , en 95% luchtvochtigheid. Cellen in de logaritmische groeifase werden geoogst voor experimenten.

Voorbereiding van DOX-geladen Chitosan NB's

We hebben NB's gemaakt volgens eerder beschreven methoden [18, 19]. Chitosan met gemiddeld molecuulgewicht (100 ~ 300 kD) werd gebruikt voor de schalen van de DOX-NB's en perfluorpropaan werd gebruikt voor de kern. Om de DOX-chitosan-oplossing te bereiden, werd de juiste dosis DOX opgelost in ultrapuur water en werd 2 ml DOX-oplossing (1 mg / ml) toegevoegd aan de chitosan-wateroplossing door 5 s te mengen met een vortexmixer. De DOX-chitosan-oplossing werd gedurende 1 uur bij 65 ° C geïncubeerd. Afzonderlijk werd een ethanoloplossing die Epikuron 200 bevatte toegevoegd aan een waterige palmitinezuuroplossing. Na toevoeging van het juiste volume ultrazuiver water, werd het palmitinezuur-Epikuron 200-systeem gehomogeniseerd met behulp van een vortexmixer. Vervolgens werd het palmitinezuur-Epikuron 200-systeem verdeeld in Eppendorf-buisjes van 1,5 ml (EP-buisjes) en werd de lucht in de buis vervangen door perfluorpropaan met behulp van een injectiespuit van 10 ml met een lange fijne naald. Elke buis werd 120 s geoscilleerd in een mechanische oscillator (Ag- en Hg-mixer, Xi'an, China). Vervolgens werd alle vloeistof in de EP-buizen van 1,5 ml in een centrifugebuis gegoten en in een ijsbad gecombineerd met de DOX-chitosan-oplossing. Vervolgens werd het mengsel 30 min bij -4°C geïncubeerd. Vervolgens een waterige oplossing van Pluronic F68 (0,01%, w /w ), een stabilisator, werd onder roeren aan het bovenstaande mengsel toegevoegd. Een dialyse-zuiveringsstap (ultrafiltratie centrifugebuis, Millipore, 30 kDa) werd vervolgens uitgevoerd om eventuele resterende vrije DOX te verwijderen.

Observatie van de fysieke eigenschappen van de NB's

De suspensie van DOX-NB's werd verdund door een geschikte hoeveelheid PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) toe te voegen. De vorm van DOX-NB's werd vervolgens waargenomen en afgebeeld onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een ×  100 olie-immersie objectieflens (OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Japan). De fluorescentiebeelden werden beoordeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Nikon TE2000-S, Japan). De morfologie van de DOX-NB's werd ook waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (JEOL, Tokyo, Japan). De waterige suspensies van de verdunde nanobellen werden op een met Formvar gecoat koperen rooster gespoten en gekleurd met 4% w /v uranylacetaat gedurende 10 min. Vervolgens werden de monsters gevisualiseerd en afgebeeld met behulp van TEM. De grootte en het zeta-potentiaal van het oppervlak van de DOX-NB's werden gemeten met een Delsa Nano C-deeltjesgrootte en zeta-potentiaalanalysator (Beckmann Instruments, VS). Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd om de gemiddelde waarde te berekenen.

Stabiliteit van DOX-NB's

De grootte en morfologie van DOX-NB's werden in de loop van de tijd gemeten om de stabiliteit van deze nanobellen te observeren. Sommige delen van de DOX-NB's werden 24 of 48 uur in de koelkast bewaard bij 4 °C. De andere werden gedurende 6 uur bij kamertemperatuur bewaard. De stabiliteit van nanobellen bij 25°C werd ook onderzocht in gevriesdroogd humaan serum (Seronorm™ Human, Noorwegen). Voor dit doel werd 1 ml van de DOX-NBs waterige suspensie toegevoegd aan 1 ml van het serum en gedurende 6 uur bij 25°C geïncubeerd. Vervolgens werden alle DOX-NB's gemeten door morfologieanalyse met behulp van optische microscopie om de integriteit van hun structuren te evalueren. De grootte van de NB's werd gemeten met een Delsa Nano C-deeltjesgrootte en zeta-potentiaalanalysator (Beckmann Instruments, VS).

Bepaling van de DOX-laadcapaciteit van NB's

Een standaardcurve van de DOX-concentratie werd bereid met behulp van seriële DOX-verdunningen in concentraties van 0,025, 0,05, 0,1 en 0,2 mg/ml en gemeten met een UV-spectrofotometer (UV-2450, SHIMADZU). Vervolgens werd de DOX-laadefficiëntie beoordeeld bij 480 nm met behulp van blanco NB's als controle, en de DOX-concentratie in DOX-NB's werd berekend op basis van de hierboven vastgestelde standaardcurve. Om de fotodegradatie van DOX tijdens het zuiverings- en meetproces te voorkomen, werden alle procedures uitgevoerd terwijl ze beschermd waren tegen licht. Vervolgens werd de suspensie van DOX-NB's 1,5 dag gevriesdroogd met een vriesdroger bij -55 °C en onder 0,080 mbar [20]. Gevriesdroogde DOX-NB's werden vervolgens gewogen om de geneesmiddellaadcapaciteit in termen van geneesmiddelinkapselingsefficiëntie (EE) als volgt te berekenen:EE = A /B × 100%, waarbij A is de hoeveelheid DOX geladen in NB's, en B is de initiële hoeveelheid DOX in de oplossing. De experimenten werden drie keer herhaald.

Echografie-gemedieerde DOX-release

De in vitro afgiftekinetiek van DOX uit de DOX-NB's werd bepaald in aanwezigheid en afwezigheid van ultrageluid (VS) door middel van dialysezaktechniek bij 37°C. De DOX-NB's waren ingesloten in een dialysemembraan (Spectra / Por, cutoff 12.000-14.000 Da), dat in een container van 100  ml PBS werd geplaatst onder schudden bij 100 rpm. De Amerikaanse groep werd gesoniceerd door de VS (VCX400, Sonics and Materials, VS; vermogensdichtheid, 1.0 W/cm2; frequentie, 20 kHz) gedurende 40 s alvorens te testen [21]. DOX-afgifte werd gemeten gedurende maximaal 24 u, waarbij op elk vast tijdstip 1 ml werd onttrokken en vervangen door 1 ml verse PBS. De concentraties van DOX in de externe buffer werden gemeten bij 480 nm met een UV-spectrofotometer. De afgifte-experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

In vitro echografie (tijd-intensiteitscurve)

De Amerikaanse beeldvorming en stabiliteit van DOX-NB's onder echografie werden in vitro geverifieerd op een klinisch echografiescannersysteem (LOGIQ E9; GE, VS). Het experiment werd uitgevoerd met specifieke frequenties, zendvermogens en duur van blootstelling aan ultrageluid. Met behulp van een eerder ontwikkelde methode [19] (Fig. 5a), bereikten DOX-NB's ultrasone verbetering. De stabiliteit van de ultrasone beeldvorming van DOX-NB's werd geëvalueerd na blootstelling aan een ultrasone stimulus met een mechanische index (MI) van 0,10 en een beelddiepte van 4,5 cm. Alle Amerikaanse afbeeldingen werden offline geanalyseerd met Image J. Vervolgens werd beeldanalyse uitgevoerd met behulp van de ingebouwde software van LOGIQ E9 om de grijswaarden van monsters te berekenen. Voor elk van de 60-s clips, die werden verkregen van 0 tot 15 min, werd eerst bewegingscorrectie uitgevoerd voor elk frame en werd de decibelwaarde verkregen. Elke decibelwaarde werd uitgezet op een tijd-intensiteitscurve om de veranderingen in contrastverbetering voor en na ultrasone bestraling weer te geven. De piekintensiteit en duur van de verbetering werden uitgedrukt door een tijd-intensiteitscurve. Tijdens de analyse werden voor het bereik gecorrigeerde terugverstrooiingswaarden verkregen door de achtergrondsignalen die overeenkomen met een watermonster af te trekken.

Cytotoxiciteitstest voor lege NB's

De bioveiligheid van lege chitosan-NB's werd getest met behulp van een Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assaykit (Sigma-Aldrich, VS). Voorafgaand aan de test werden MCF-7-cellen uitgeplaat met een dichtheid van 2 × 10 ³ cellen/putje in platen met 96 putjes. De cellen werden onderworpen aan een behandeling door variërende concentraties van chitosan-NB's en ultrasone omstandigheden. De bioveiligheid van chitosan-NB's werd geëvalueerd door MCF-7-cellen te incuberen bij seriële concentraties van NB's van 0 tot 30%. Apparatuur voor ultrasone stimulatie met lage intensiteit (US10, Cosmogamma Corporation, Italië) werd gebruikt om ultrasone stimulatie uit te voeren met een vaste frequentie van 1 MHz, met een werkcyclus van 70% en een pulsfrequentie van 100 Hz. Elke groep verwerkt met verschillende bestralingstijd en verschillende geluidsintensiteit. Om veiligheidsredenen werd echografie gebruikt met een intensiteit van 0,5 W/cm ² of 1,0 W/cm ² met een pulslengte van 30 of 60 s (tabel 1). De diepte, frequentie en andere ultrasone condities werden consistent gehouden tijdens alle ultrasone experimenten [22]. Na de behandelingen werden de cellen nog eens 24 uur in de platen met 96 putjes gekweekt. Vervolgens werd een onderhoudsmedium met 1% FCS gebruikt om het geneesmiddelbevattende medium te vervangen en werd een CCK-8-oplossing aan de platen toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. Na een extra incubatie van 2,5 uur bij 37 °C werd de spectrofotometrische absorptie in elk putje bepaald met behulp van een microplaatlezer (Bio-Rad, VS) bij een golflengte van 450 nm.

Intracellulaire opname van geneesmiddelen in vitro

De intracellulaire opname van DOX werd bepaald door flowcytometrie (Beckman Coulter, Miami, VS). In het kort, MCF-7-cellen werden uitgeplaat in platen met zes putjes met een dichtheid van 2,5 × 10 ⁵ cellen/putje in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS. Na een nachtkweek werd het medium vervangen door een kweekmedium dat DOX-NB's of vrij DOX in dezelfde concentratie bevatte, en de cellen werden behandeld met of zonder ultrageluid. Met het oog op de levensvatbaarheid van de cellen en de hoge efficiëntie van de sonoporatie, werd voor de daaropvolgende experimenten een DOX-NBs-concentratie van 20% gekozen, terwijl de ultrasone behandeling werd ingesteld op een intensiteit van 0,5 W/cm ² met een pulslengte van 30 of 60 s. Vervolgens werd na 1 uur incubatie het celmedium verwijderd en werden de cellen driemaal gewassen met verse PBS om vrije en ongebonden DOX-NB's of DOX te verwijderen. De cellen werden vervolgens verzameld door centrifugeren (5 min, 1000 rpm), opnieuw gesuspendeerd in 500  μL PBS voorafgaand aan de intracellulaire opname van DOX en geanalyseerd op een FACSCalibur-flowcytometer. Tijdens de analyse werd de poort willekeurig ingesteld voor de detectie van rode fluorescentie en werden voor elk monster 10.000 cellen geanalyseerd.

De effecten van DOX-NB's op MCF-7-cellen in vitro

CCK-8-assays en flowcytometrie werden gebruikt om kwantitatieve evaluatie van MCF-7-celproliferatie en apoptose na opname van DOX uit te voeren. In het kort werden MCF-7-cellen uitgeplaat en geïncubeerd in platen met 96 putjes of platen met 6 putjes en behandeld met behulp van de hierboven beschreven procedures. Voor de proliferatietest werden de behandelde cellen 24 uur bij 37°C geïncubeerd, gevolgd door CCK-8-kleuring gedurende 2 uur en absorptieaflezing op een microplaatlezer. DOX-geïnduceerde apoptose werd als volgt bepaald door een Annexin V-APC-assay:na een behandeling van zes uur werden de cellen gekleurd door 0,5 L V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, China) toe te voegen aan elk putje en flowcytometrie-analyse (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, VS) werd gebruikt om apoptotische cellen te kwantificeren.

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde. Statistische analyses zijn uitgevoerd met SPSS versie 18.0. Een p waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Fysisch-chemische karakterisering van DOX-NB's

De voorbereide NB's vertoonden een bolvormige morfologie. Onder een omgekeerde microscoop vertoonde beeldvorming van NB's discrete en intacte bolvormige contouren (figuur 1a), wat consistent was met de fluorescentiemicroscoopbeeldvorming van DOX-NB's (figuur 1b). Een representatief TEM-beeld van de oplossing van DOX-NBs wordt getoond in Fig. 1c. De fysieke eigenschappen van de NB's werden bepaald door de deeltjesgrootte en de zeta-potentiaalanalysator. Zoals getoond in Fig. 2 was de gemiddelde diameter van DOX-NB's 641 nm, P.I. 0,256. Het zeta-potentieel van DOX-NB's was +-67,12 ± -2,1 mV, wat voldoende hoog was om ervoor te zorgen dat ze elkaar afstoten, wat helpt bij het voorkomen van NB-aggregatie en hun stabiliteit op lange termijn ondersteunt.

NB's waargenomen onder een lichtmicroscoop (vergroting × 1000) (a ) en het fluorescentiemicroscoopbeeld van DOX-geladen NB's (b ) en TEM-afbeelding van DOX-geladen NB's (c )

De grootteverdeling van DOX-geladen NB's

Stabiliteit en efficiëntie van het laden van geneesmiddelen van DOX-NB's

De DOX-NB's waren 48 uur stabiel in suspensie bij 4 °C. Na te zijn bewaard bij kamertemperatuur, bleek de grootte van DOX-NB's iets groter te zijn, zowel in PBS als in menselijk serum (figuur 3). De uiteindelijke laadcapaciteit van DOX-NB's was 64,12 mg DOX/g DOX-NB's, wat overeenkwam met een EE van 54,18%.

Optische beelden van DOX-NB's a bij kamertemperatuur, b na 6 h bij 25°C in PBS, en c na 6 u bij 25°C in het serum

DOX-afgifte door DOX-NB's in vitro

Figuur 4 toont het in vitro-afgifteprofiel van DOX van DOX-NB's in PBS in aanwezigheid of afwezigheid van een Amerikaanse behandeling om de effecten van ultrasoonapparaat op DOX-afgifte te beoordelen. De hoeveelheid DOX die vrijkwam uit DOX-NB's was significant verschillend tussen de Amerikaanse groep en de niet-Amerikaanse groep. Na 5,5 uur hadden de DOX-NB's in de Amerikaanse groep 46,45% van de ingekapselde DOX afgegeven, vergeleken met slechts 9,3% in de niet-Amerikaanse groep. De niet-Amerikaanse groep gaf na 24 uur slechts 19,4% DOX vrij. Daarentegen werd bijna 80% van DOX geloosd in de Amerikaanse groep. De resultaten suggereerden dat bestraling in de VS de afgifte van DOX uit DOX-NB's kan bevorderen vanwege een cavitatie-effect.

Doxorubicineafgifte uit DOX-NB's met of zonder ultrasone bestraling (2 kHz, 1,0 W/cm ² )

Echografiestabiliteit van DOX-NB's

DOX-NB's bereikten in vitro ultrasone verbetering, zoals getoond in Fig. 5b. De demping van de ultrasone decibelwaarde wordt getoond in Fig. 5c. De resultaten toonden aan dat DOX-NB's een goede ultrasone verbetering bereikten, en de vloeiende curve toont aan dat het ultrasone verzwakkingsproces in de NB-suspensies relatief langzaam was. Dit geeft aan dat het ultrasone signaal van DOX-NB's stabiel genoeg kan zijn voor beeldvorming en contrastverbetering.

Een schematische illustratie van de in vitro experimentele opstelling (a ), ultrasone beelden van DOX-geladen NB's (0, 5, 10 en 15 min) met behulp van een 9,0-MHz-sonde (b ) en tijdintensiteitsmetingen van ultrasoon-contrast en DOX-geladen NB's (c )

Bioveiligheid van lege NB's

De levensvatbaarheid van MCF-7-cellen werd gemeten door 24 uur na echografie te kweken met lege NB's (zonder DOX). Zoals getoond in Fig. 6, hadden de lege NB's geen significante invloed op de levensvatbaarheid van de cellen onder bepaalde ultrasone intensiteiten. Bij gebruik van een ultrasone intensiteit van 0,5 W/cm ² en een bestralingstijd van 30 µs, 99,53% en>-80% van de MCF-7-cellen leefden in respectievelijk 10% en 30% NBs-suspensies (groep 1), en de afname van de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen was dosisafhankelijk. Bovendien waren ultrasone intensiteit en bestralingstijd twee andere factoren die de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen beïnvloedden. In het bijzonder, wanneer de concentratie van lege NB's 30% was, werden de MCF-7-cellen behandeld met 0,5 W/cm ² gedurende 30 s vertoonden een hogere levensvatbaarheid dan die behandeld met 0,5 W/cm ² voor 60 s of 1 W/cm ² voor 30 s (0,84% vs. 0,75% vs. 0,63%). Daarom een ​​ultrasone intensiteit van 0,5 W/cm ² en een bestralingstijd van 30 s/60 s werden gebruikt voor celopname-experimenten.

In vitro cytotoxiciteit van verschillende NBs-concentraties en geluidsintensiteit in MCF-7-cellen

Verbetering van in vitro DOX-afgifte gemedieerd door DOX-NB's en ultrasone bestraling

De MCF-7-cellen behandeld met DOX-NB's of vrije DOX (bij gelijke DOX-concentraties) werden gefixeerd en hun fluorescentie-intensiteit werd gemeten met flowcytometrie. Cellen die geen DOX-behandeling ontvingen, werden als blanco controles gebruikt. De cellulaire opname van DOX in de DOX-NBs-groep werd vergeleken met die van vrije DOX en de controlegroep. In Fig. 7 was de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van MCF-7-cellen die waren geïncubeerd met DOX-NB's veel lager dan de autofluorescentie van cellen die waren geïncubeerd met vrije DOX, wat illustreert dat de inkapseling van DOX in chitosan-NB's cellen zou kunnen beschermen tegen DOX-opname en DOX- veroorzaakt letsel.

Flowcytometrie-analyse van DOX-afgifte in MCF-7-cellen door DOX-geladen NB's (US1 0,5 W/cm ² 30 s, US2 0,5 W/cm ² 60 s)

Ultrageluidbestraling resulteerde echter in een duidelijke toename van de DOX-opname in MCF-7-cellen die waren geïncubeerd met DOX-NB's; DOX-NB's zouden met behulp van ultrasone bestraling meer DOX in MCF-7-cellen kunnen afleveren. Daarentegen was de DOX-opname in MCF-7-cellen die waren geïncubeerd met vrij DOX slechts licht verhoogd onder ultrasone bestraling. De resultaten suggereerden dat de opname van DOX in MCF-7-cellen die waren geïncubeerd met DOX-NB's veel hoger was dan die van de cellen die waren geïncubeerd met vrije DOX onder ultrasone bestraling.

Bovendien was de DOX-opname in MCF-7-cellen die waren geïncubeerd met DOX-NB's iets verhoogd bij een langere bestralingstijd. Dit kan te wijten zijn aan een verhoogde breuk van DOX-NB's, waardoor tijdelijke poriën op de membranen van MCF-7-cellen ontstaan.

Verbetering van door DOX geïnduceerde proliferatie en apoptose van tumorcellen door ultrasone bestraling

Om de antikankereffecten van door echografie ondersteunde DOX-NBs-afgifte te onderzoeken, werd de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen gemeten met behulp van een CCK-8-assay en flowcytometrie. De resultaten laten zien dat de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen in de DOX-NBs-groep hoger was dan die in de DOX-groep zonder echografie. Ondertussen was de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen in de DOX-NBs-groep significant lager dan die in de DOX-groep met lokale ultrasone bestraling. De verhouding van cellevensvatbaarheid in de DOX-NBs-groep (21,0 ± 2,2%, p <-0,01) was veel hoger dan die in de vrije DOX-groep zonder ultrasone bestraling (6,4 ± 0,7%), wat suggereert dat als vectoren voor medicijnafgifte, NB's de door DOX geïnduceerde afname van celproliferatie in de bloedcirculatie verbeteren.

Bovendien was de verhouding van cellevensvatbaarheid significant verlaagd in cellen die werden behandeld met DOX-NBs + US (3,1 ± 0,8%, 2,2 ± 0,9%) vergeleken met die behandeld met alleen DOX-NBs (21,0 ± 2,2%, p <-0,01), vrije DOX alleen (6,4 ± 0,7%) en gratis DOX + echografie (4,1 ± 0,8%, 3,8 ± 0,6%) (Fig. 8). De gegevens gaven aan dat DOX-NBs + US de cytotoxische effecten van DOX in MCF-7-cellen significant versterkten. De DOX-NBs + US-groep vertoonde ook een grotere cytotoxiciteit in MCF-7-cellen dan de vrije DOX- en vrije DOX + -echografiegroepen.

De vergelijking van de levensvatbaarheid van cellen in verschillende groepen

De ratio van cellevensvatbaarheid in de vrije DOX + ultrageluidgroep (4,1 ± 0,8%) was lager dan die in de vrije DOX-groep (6,4 ± 0,7%). Daarom verminderde echografie ook de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen die werden behandeld met gratis DOX. De verhouding van cellevensvatbaarheid was 2,2 ± 0,9% wanneer de cellen werden behandeld met DOX-NBs + ultrageluid (60 s), wat lager was dan wanneer behandeld met DOX-NBs + ultrageluid (30 s) (3,1 ± 0,8%), wat aangeeft dat de langere pulslengte (60 s) efficiënter was bij de levering van DOX-NB's.

Verder werd de apoptose van MCF-7-cellen beoordeeld door Annexine V-kleuring 6 uur na gratis DOX- of DOX-NB-behandeling, met of zonder ultrasone bestraling. Het percentage apoptotische MCF-7-cellen in de aanwezigheid van vrije DOX was 4,4 ± ± 0,9%, terwijl een vergelijkbare verhouding werd waargenomen in cellen behandeld met vrije DOX en ultrageluid (30 s, 60 s). Afgifte van de door echografie ondersteunde DOX-NB's verhoogde het percentage apoptotische cellen significant in vergelijking met dat van de vrije DOX-groep (45,7 ±-1,1% vs. 4,4 ± 0,9%, p < 0.01). Bovendien was het percentage apoptotische cellen in de DOX-NBs-groep zonder ultrasone bestraling lager dan dat van de vrije DOX-behandelingsgroep (3,2 ± -0,9% versus 4,4 ± -0,9%). In overeenstemming met de cellevensvatbaarheidstest gaven deze gegevens aan dat door echografie geassisteerde DOX-NBs-afgifte het antikankereffect van DOX versterkte.

Discussie

Borstkanker heeft steeds meer aandacht gekregen vanwege de hoge incidentie en sterftecijfers. Volgens een rapport van Globocan is borstkanker de meest voorkomende oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen in minder ontwikkelde regio's [23]. DOX is een populair middel tegen borstkanker omdat het DNA-schade kan veroorzaken [24]. Het kan echter ook ernstige bijwerkingen veroorzaken, zoals cardiotoxiciteit, in klinische toepassingen [25]. Om dergelijke toxische effecten te overwinnen, zijn efficiënte medicijnafgiftesystemen nodig die zich alleen richten op kankercellen, waardoor de medicijnconcentratie op de doellocaties wordt verhoogd en deze in niet-doelweefsels wordt verminderd [26]. In dit werk werden DOX-geladen biologische chitosan NB's ontworpen, die, indien gebruikt in combinatie met echografie, DOX richting borstkankercellen konden transporteren.

Biologische chitosan-NB's bestaande uit lecithine en palmitinezuur zijn geformuleerd en gebruikt voor MRI/echografie-detectie, genafgifte en zuurstofafgifte [13, 18, 27]. De capaciteit voor het laden van geneesmiddelen en de afgifte-efficiëntie van biologische chitosan-NB's zijn echter verre van optimaal. Marano et al. gecombineerde DOX-geladen glycolchitosan NB's en extracorporale schokgolven (ESW's) om de antitumoractiviteit van DOX te verbeteren [28]. Maar ESW's beschikken niet over de beeldvormingscapaciteit om de tumorgrootte te beoordelen en de locatie nauwkeurig te detecteren. Bovendien, hoewel ernstige bijwerkingen van ESW's zeldzaam zijn, kunnen ze voorbijgaande hartritmestoornissen veroorzaken [29]. De metabolieten van glycol, waaronder glycolaat en precipitatie van calciumoxalaat, kunnen ook ernstige metabole acidose veroorzaken [30]. Vergeleken met ESW's heeft echografie grotere voordelen vanwege het beeldvormende vermogen, niet-invasiviteit en veiligheid.

In deze studie werden nieuwe DOX-NB's bereid met perfluorpropaan als de kern en chitosan als de schaal. Chitosan kan macrofagen activeren en kan ook hun pro-inflammatoire functies versterken [31]. Opgemerkt moet worden dat positief geladen DOX-NB's een sterke interactie kunnen hebben met bloedcomponenten, wat resulteert in een snelle klaring uit het bloed en suboptimale gerichte accumulatie op de tumorplaats [32]. Om dit probleem te verhelpen, werd het oppervlak van DOX-NB's gecoat met Pluronic F-68, een amfifiel en niet-ionisch blokcopolymeer gevormd door propyleenoxide en ethyleeneenheden, dat ook de aggregatie van nanobellen door sterische stabilisatie kan voorkomen [13, 33 ].

Ensuring the biosafety of NBs is fundamental to their clinical application. In this study, the safety of chitosan NBs was monitored via cell viability, which showed no obvious effect on cell viability with a chitosan NB concentration of 10% and ultrasound treatment (0.5 W/cm ² , 30 s), suggesting low cytotoxicity of chitosan NBs. Indeed, even treatment with a high dosage (30%) of chitosan NBs resulted in less than 20% observable cell death. The results showed that cell viability in chitosan NBs was much higher than that in lipid-coated nanobubbles [19], indicating that chitosan NBs were highly biocompatible with MCF-7 cells and that the cell death observed in this study may be due to the energy released by ultrasound-induced NB disruption. The high safety profile of biocompatible chitosan NBs renders them suitable for loading other drugs in the future.

Our research shows that US irradiation can effectively promote the release of DOX from DOX-NBs and subsequent cellular uptake of DOX in vitro. Exposure of cells to DOX-NBs and ultrasound resulted in near instantaneous cellular entry of DOX. The reason for this is that sonoporation is a process by which ultrasonically activated ultrasound contrast agents pulsate near biological barriers (cell membranes or endothelial layers), increasing their permeability and thereby enhancing the extravasation of external substances. In this way, drugs and genes can be delivered inside individual cells [34]. Our data showed that the cellular uptake of DOX was significantly higher in the DOX-NBs group than in the free DOX group when ultrasound-assisted delivery was applied. Meanwhile, without ultrasound, MCF-7 cells in the free DOX group showed increased DOX uptake than those in the DOX-NBs group, indicating that the chitosan NBs could reduce cellular uptake of DOX in normal tissues and protect them in the absence of ultrasonic irradiation.

Chen et al. showed that the carrier-free HCPT/DOX nanoparticles enhanced synergistic cytotoxicity against breast cancer cells in vitro [35], but they could not reduce DOX cytotoxicity and its toxicity in the circulation. A biophysical research group from Vytautas Magnus University proposed combining DOX-liposomes with microbubbles and US to enhance targeting [36]. Their results showed that the cell survival rate of DOX-liposomes decreased by 60~70% when microbubbles and ultrasound were present. By comparison, the cell survival rate of the DOX-NBs + US group in our study was 85.3% or 89.5% ((21–3.1 or 21–2.2)/21) lower than that of the DOX-NBs group. This proves that the combination of DOX-NBs and US are more effective in transporting DOX than DOX-liposomes combined with microbubbles and US. We also found that the cells in the DOX-NBs + US group showed a higher rate of apoptosis than those in the free DOX and DOX-NBs only groups. This finding was not unexpected as greater accumulation of DOX in cancer cells can increase cell death, consistent with a previous report [37].

Conclusies

In summary, DOX-loaded biocompatible chitosan NBs were successfully prepared using a combination of biological surfactants. The prepared NBs possessed a good ability to achieve ultrasound enhancement and excellent biosafety. The in vitro results demonstrated that DOX­NBs are an innovative drug delivery system that may be useful in obtaining efficient ultrasound­assisted DOX delivery for the treatment of mammary cancer.

Afkortingen

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DMEM:

Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

EE:

Inkapselingsefficiëntie

EP tubes:

Eppendorf tubes

ESWs:

Extracorporeal shock waves

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

NBs:

Nanobubbles

US:

Ultrasound

UTN/MD:

Ultrasound-targeted nano/microbubble destruction