Insuline

Achtergrond

Insuline is een hormoon dat de hoeveelheid glucose (suiker) in het bloed regelt en nodig is om het lichaam normaal te laten functioneren. Insuline wordt geproduceerd door cellen in de pancreas, de eilandjes van Langerhans. Deze cellen geven continu een kleine hoeveelheid insuline aan het lichaam af, maar ze geven schommelingen van het hormoon af als reactie op een stijging van de bloedglucosespiegel.

Bepaalde cellen in het lichaam veranderen het ingenomen voedsel in energie, of bloedglucose, die cellen kunnen gebruiken. Elke keer dat een persoon eet, stijgt de bloedglucose. Een verhoogde bloedglucose zorgt ervoor dat de cellen in de eilandjes van Langerhans de benodigde hoeveelheid insuline afgeven. Insuline zorgt ervoor dat de bloedglucose vanuit het bloed naar de cellen kan worden getransporteerd. Cellen hebben een buitenwand, een membraan genaamd, die bepaalt wat de cel binnenkomt en verlaat. Onderzoekers weten nog niet precies hoe insuline werkt, maar wel dat insuline zich bindt aan receptoren op het celmembraan. Dit activeert een set transportmoleculen zodat glucose en eiwitten de cel kunnen binnendringen. De cellen kunnen de glucose dan gebruiken als energie om zijn functies uit te voeren. Eenmaal in de cel getransporteerd, wordt de bloedglucosespiegel binnen enkele uren weer normaal.

Zonder insuline stapelt de bloedglucose zich op in het bloed en worden de cellen verhongerd van hun energiebron. Enkele van de symptomen die kunnen optreden zijn vermoeidheid, constante infecties, wazig zicht, gevoelloosheid, tintelingen in de handen of benen, verhoogde dorst en vertraagde genezing van blauwe plekken of snijwonden. De cellen zullen vet gaan gebruiken, de energiebron die is opgeslagen voor noodgevallen. Wanneer dit te lang gebeurt, produceert het lichaam ketonen, chemicaliën die door de lever worden geproduceerd. Ketonen kunnen cellen vergiftigen en doden als ze zich gedurende langere tijd in het lichaam ophopen. Dit kan leiden tot ernstige ziekte en coma.

Mensen die niet de benodigde hoeveelheid insuline aanmaken, hebben diabetes. Er zijn twee algemene soorten diabetes. Het ernstigste type, bekend als type I of jeugddiabetes, is wanneer het lichaam geen insuline aanmaakt. Type I diabetici injecteren zichzelf gewoonlijk drie tot vier keer per dag met verschillende soorten insuline. De dosering wordt genomen op basis van de bloedglucosemeting van de persoon, afkomstig van een glucosemeter. Type II diabetici produceren wat insuline, maar dat is niet genoeg of hun cellen reageren niet normaal op insuline. Dit komt meestal voor bij zwaarlijvige of middelbare leeftijd en oudere mensen. Type II diabetici hoeven niet per se insuline te gebruiken, maar ze kunnen één of twee keer per dag insuline injecteren.

Er zijn vier hoofdtypen insuline die worden vervaardigd op basis van hoe snel de insuline begint te werken, wanneer deze een piek bereikt en hoe lang deze in het lichaam aanwezig blijft. Volgens de American Diabetes Association bereikt snelwerkende insuline het bloed binnen 15 minuten, piekt na 30-90 minuten en kan vijf uur duren. Kortwerkende insuline bereikt het bloed binnen 30 minuten, piekt ongeveer twee tot vier uur later en blijft vier tot acht uur in het bloed. Intermediair werkende insuline bereikt het bloed twee tot zes uur na injectie, piekt vier tot 14 uur later en kan 14-20 uur in het bloed aanwezig blijven. En het duurt zes tot veertien uur voordat langwerkende insuline begint te werken, het heeft kort daarna een kleine piek en blijft 20-24 uur in het bloed. Diabetici hebben elk verschillende reacties op en behoeften aan insuline, dus er is niet één type dat voor iedereen het beste werkt. Sommige insuline wordt verkocht met twee van de typen in één fles gemengd.

Geschiedenis

Als het lichaam geen of onvoldoende insuline aanmaakt, moeten mensen een gefabriceerde versie ervan nemen. Het belangrijkste gebruik van het produceren van insuline is voor diabetici die van nature niet genoeg of geen insuline maken.

Voordat onderzoekers ontdekten hoe ze insuline konden aanmaken, hadden mensen met diabetes type I geen kans op een gezond leven. In 1921 zuiverden de Canadese wetenschappers Frederick G. Banting en Charles H. Best met succes insuline uit de alvleesklier van een hond. In de loop der jaren hebben wetenschappers voortdurend verbeteringen aangebracht in de productie van insuline. In 1936 vonden onderzoekers een manier om insuline te maken met een langzamere afgifte in het bloed. Ze voegden een eiwit toe dat voorkomt in vissperma, protamine, dat het lichaam langzaam afbreekt. Eén injectie duurde 36 uur. Een andere doorbraak kwam in 1950 toen onderzoekers een type insuline produceerden dat iets sneller werkte en niet zo lang in de bloedbaan blijft. In de jaren zeventig begonnen onderzoekers te proberen een insuline te produceren die meer nabootste hoe de natuurlijke insuline van het lichaam werkte:de hele dag een kleine hoeveelheid insuline afgeven met pieken tijdens de maaltijden.

Onderzoekers bleven insuline verbeteren, maar de basisproductiemethode bleef decennialang hetzelfde. Insuline werd gewonnen uit de pancreas van runderen en varkens en gezuiverd. De chemische structuur van insuline bij deze dieren is maar een klein beetje anders dan bij humane insuline, en daarom functioneert het zo goed in het menselijk lichaam. (Hoewel sommige mensen een negatief immuunsysteem of allergische reacties hadden.) Toen, in het begin van de jaren tachtig, zorgde biotechnologie voor een revolutie in de insulinesynthese. Onderzoekers hadden de chemische structuur van insuline al in het midden van de jaren vijftig gedecodeerd. Ze bepaalden al snel de exacte locatie van het insulinegen bovenaan chromosoom 11. In 1977 had een onderzoeksteam een ​​insulinegen van ratten gesplitst in een bacterie die vervolgens insuline produceerde.

Frederick Bonting.

In 1891 werd Frederick Banting geboren in Alliston, Ontario. Hij studeerde in 1916 af aan de medische faculteit van de Universiteit van Toronto. Na de dienst van het Medisch Corps in de Eerste Wereldoorlog raakte Banting geïnteresseerd in diabetes en bestudeerde hij de ziekte aan de University of Western Ontario.

In 1919 toonde Moses Barron, een onderzoeker aan de Universiteit van Minnesota, aan dat verstopping van het kanaal dat de twee belangrijkste delen van de pancreas verbindt, veroorzaakte verschrompeling van een tweede celtype, de acinar. Banting geloofde dat hij door de ductus pancreaticus af te binden om de acinaire cellen te vernietigen, het hormoon kon behouden en het uit eilandjescellen kon halen. Banting stelde dit voor aan het hoofd van de afdeling Fysiologie van de Universiteit van Toronto, John Macleod. Macleod verwierp het voorstel van Banting, maar leverde laboratoriumruimte, 10 honden en een medische student, Charles Best

Vanaf mei 1921 bonden Banting en Best de kanalen van de alvleesklier bij honden af, zodat de acinaire cellen zouden atrofiëren, en verwijderden vervolgens de pancreas om vloeistof uit eilandcellen te extraheren. Ondertussen verwijderden ze de alvleesklier van andere honden om diabetes te veroorzaken, en injecteerden ze vervolgens de vloeistof van de eilandjes. In januari 1922 werd de 14-jarige Leonard Thompson de eerste mens die met succes werd behandeld voor diabetes met behulp van insuline.

Best behaalde zijn medische graad in 1925. Banting stond erop dat ook Best zou worden gecrediteerd, en wees bijna zijn Nobelprijs af omdat Best er niet bij was. Best werd in 1929 hoofd van de afdeling fysiologie van de Universiteit van Toronto en directeur van de Banting en Best Department of Medical Research van de universiteit na de dood van Banting in 1941.

In de jaren tachtig gebruikten onderzoekers genetische manipulatie om een ​​humane insuline te maken. In 1982 produceerde de Eli Lilly Corporation een humane insuline die het eerste goedgekeurde genetisch gemanipuleerde farmaceutische product werd. Zonder afhankelijk te zijn van dieren, zouden onderzoekers onbeperkt genetisch gemanipuleerde insuline kunnen produceren. Het bevatte ook geen van de dierlijke verontreinigingen. Het gebruik van humane insuline nam ook alle zorgen weg over het overbrengen van mogelijke dierziekten naar de insuline. Hoewel bedrijven vanaf de jaren tachtig nog steeds een kleine hoeveelheid insuline verkopen die is geproduceerd door dieren, voornamelijk varkens, zijn insulinegebruikers steeds meer overgestapt op een vorm van humane insuline die is gemaakt met behulp van recombinant-DNA-technologie. Volgens de Eli Lilly Corporation slikte in 2001 95% van de insulinegebruikers in de meeste delen van de wereld een of andere vorm van humane insuline. Sommige bedrijven zijn volledig gestopt met het produceren van dierlijke insuline. Bedrijven richten zich op het synthetiseren van humane insuline en insuline-analogen, op de een of andere manier een wijziging van het insulinemolecuul.

Grondstoffen

Menselijke insuline wordt in het laboratorium gekweekt in gewone bacteriën. Escherichia coli is veruit de meest gebruikte bacteriesoort, maar er wordt ook gebruik gemaakt van gist.

Onderzoekers hebben het menselijke eiwit nodig dat insuline produceert. Fabrikanten krijgen dit via een aminozuursequencing-machine die het DNA synthetiseert. Fabrikanten kennen de exacte volgorde van de aminozuren van insuline (de op stikstof gebaseerde moleculen die in de rij staan ​​om eiwitten te vormen). Er zijn 20 veel voorkomende aminozuren. Fabrikanten voeren de aminozuren van insuline in en de sequencing-machine verbindt de aminozuren met elkaar. Ook nodig om insuline te synthetiseren zijn grote tanks om de bacteriën te laten groeien, en voedingsstoffen zijn nodig om de bacteriën te laten groeien. Er zijn verschillende instrumenten nodig om het DNA te scheiden en te zuiveren, zoals een centrifuge, evenals verschillende instrumenten voor chromatografie en röntgenkristallografie.

Het fabricageproces

Het synthetiseren van humane insuline is een biochemisch proces in meerdere stappen dat afhangt van basale recombinant-DNA-technieken en kennis van het insulinegen. DNA bevat de instructies voor hoe het lichaam werkt en een klein segment van het DNA, het insulinegen, codeert voor het eiwit insuline. Fabrikanten manipuleren de biologische voorloper van insuline zodat het in eenvoudige bacteriën groeit. Hoewel fabrikanten elk hun eigen variaties hebben, zijn er twee basismethoden om humane insuline te produceren.

Werken met humane insuline

• 1 Het insulinegen is een eiwit dat bestaat uit twee afzonderlijke ketens van aminozuren, een A boven een B-keten, die met bindingen bij elkaar worden gehouden. Aminozuren zijn de basiseenheden die alle eiwitten bouwen. De insuline A-keten bestaat uit 21 aminozuren en de B-keten heeft 30.
• 2 Voordat insuline een actief insuline-eiwit wordt, wordt het eerst geproduceerd als prepro-insuline. Dit is een enkele lange eiwitketen met de A- en B-ketens nog niet gescheiden, een sectie in het midden die de ketens met elkaar verbindt en een signaalsequentie aan het ene uiteinde die het eiwit vertelt wanneer het buiten de cel moet beginnen met afscheiden. Na prepro-insuline evolueert de keten naar pro-insuline, nog steeds een enkele keten maar zonder de signaalsequentie. Dan komt het actieve eiwit insuline, het eiwit zonder de sectie die de A- en B-ketens verbindt. Bij elke stap heeft het eiwit specifieke enzymen nodig (eiwitten die chemische reacties uitvoeren) om de volgende vorm van insuline te produceren.

BEGINNEN MET A EN B

• 3 Een methode om insuline te produceren is om de twee insulineketens afzonderlijk te laten groeien. Dit voorkomt de productie van elk van de specifieke enzymen die nodig zijn. Fabrikanten hebben de twee mini-genen nodig:een die de A-keten produceert en een voor de B-keten. Omdat de exacte DNA-sequentie van elke keten bekend is, synthetiseren ze het DNA van elk mini-gen in een aminozuursequencing-machine.
• 4 Deze twee DNA-moleculen worden vervolgens ingevoegd in plasmiden, kleine cirkelvormige stukjes DNA die gemakkelijker worden opgenomen door het DNA van de gastheer.
• 5 Fabrikanten brengen de plasmiden eerst in een niet-schadelijk type van de bacterie E. coli. Ze plaatsen het naast de lacZ gen. LacZ codeert voor 8-galactosidase, een gen dat veel wordt gebruikt in recombinant-DNA-procedures omdat het gemakkelijk te vinden en te knippen is, waardoor de insuline gemakkelijk kan worden verwijderd zodat het niet verloren gaat in het DNA van de bacterie. Naast dit gen bevindt zich het aminozuur methionine, dat de eiwitvorming in gang zet.
• 6 De recombinante, nieuw gevormde plasmiden worden vermengd met de bacteriecellen. Plasmiden komen de bacteriën binnen in een proces dat transfectie wordt genoemd. Fabrikanten kunnen aan de cellen DNA-ligase toevoegen, een enzym dat als lijm werkt om het plasmide te helpen zich aan het DNA van de bacterie te hechten.
• 7 De bacteriën die de insuline synthetiseren ondergaan vervolgens een fermentatieproces. Ze worden bij optimale temperaturen in grote tanks in fabrieken gekweekt. De miljoenen bacteriën vermenigvuldigen zich ongeveer elke 20 minuten door celmitose en elk brengt het insulinegen tot expressie.
• 8 Na vermenigvuldiging worden de cellen uit de tanks gehaald en opengebroken om het DNA te extraheren. Een gebruikelijke manier om dit te doen is door eerst een mengsel van lysozoom toe te voegen dat de buitenste laag van de celwand verteert, en vervolgens een detergensmengsel toe te voegen dat het membraan van de vetcelwand scheidt. Het DNA van de bacterie wordt vervolgens behandeld met cyanogeenbromide, een reagens dat eiwitketens op de methionineresten splitst. Dit scheidt de insulineketens van de rest van het DNA.
• 9 De twee ketens worden vervolgens met elkaar gemengd en verbonden door disulfidebindingen door de reductie-reoxidatiereactie. Een oxidatiemiddel (een materiaal dat oxidatie of de overdracht van een elektron veroorzaakt) wordt toegevoegd. De batch wordt vervolgens in een centrifuge geplaatst, een mechanisch apparaat dat snel ronddraait om celcomponenten te scheiden op grootte en dichtheid.
• 10 Het DNA-mengsel wordt vervolgens gezuiverd, zodat alleen de insulineketens overblijven. Fabrikanten kunnen het mengsel zuiveren door middel van verschillende chromatografie- of scheidingstechnieken die gebruikmaken van verschillen in lading, grootte en affiniteit van het molecuul voor water. Gebruikte procedures omvatten een ionenuitwisselingskolom, omgekeerde fase vloeistofchromatografie met hoog scheidend vermogen en een gelfiltratiechromatografiekolom. Fabrikanten kunnen insulinebatches testen om er zeker van te zijn dat geen van de bacteriën E. coli eiwitten worden gemengd met de insuline. Ze gebruiken een markereiwit waarmee ze E. coli . kunnen detecteren DNA. Ze kunnen dan vaststellen dat het zuiveringsproces de E. coli . verwijdert bacteriën.

PRO-INSULIN PROCES

• 11 Vanaf 1986 begonnen fabrikanten een andere methode te gebruiken om humane insuline te synthetiseren. Ze begonnen met de directe voorloper van het insulinegen, proinsuline. Veel van de stappen zijn hetzelfde als bij het produceren van insuline met de A- en B-ketens, behalve dat bij deze methode de aminozuurmachine het proinsuline-gen synthetiseert.
• 12 De sequentie die codeert voor proinsuline wordt ingevoegd in de niet-pathogene E. coli bacteriën. De bacteriën gaan door het fermentatieproces waar het zich voortplant en pro-insuline produceert. Vervolgens wordt de verbindende sequentie tussen de A- en B-ketens weggesplitst met een enzym en wordt de resulterende insuline gezuiverd.
• 13 Aan het einde van het productieproces worden ingrediënten aan insuline toegevoegd om bacteriën te voorkomen en om een ​​neutraal evenwicht tussen zuren en basen te behouden. Er worden ook ingrediënten toegevoegd aan middellang- en langwerkende insuline om de gewenste soort insuline te produceren. Dit is de traditionele methode om langerwerkende insuline te produceren. Fabrikanten voegen ingrediënten toe aan de gezuiverde insuline die hun werking verlengen, zoals zinkoxide. Deze additieven vertragen de opname in het lichaam. Additieven variëren tussen verschillende merken van hetzelfde type insuline.

Analoge insuline

Halverwege de jaren negentig begonnen onderzoekers de manier waarop humane insuline in het lichaam werkt te verbeteren door de aminozuurvolgorde te veranderen en een analoog te creëren, een chemische stof die een andere stof goed genoeg nabootst om de cel voor de gek te houden. Analoge insuline klontert minder en verspreidt zich gemakkelijker in het bloed, waardoor de insuline minuten na een injectie in het lichaam begint te werken. Er zijn verschillende analoge insulines. Humuline-insuline heeft geen sterke binding met andere insuline en wordt daarom snel opgenomen. Een ander insuline-analoog, Glargine genaamd, verandert de chemische structuur van het eiwit zodat het een relatief constante afgifte heeft gedurende 24 uur zonder uitgesproken pieken.

In plaats van de exacte DNA-sequentie voor insuline te synthetiseren, synthetiseren fabrikanten een insulinegen waarbij de sequentie enigszins is gewijzigd. De verandering veroorzaakt de resulterende Een diagram van de productiestappen voor insuline. eiwitten stoten elkaar af, waardoor er minder klontervorming optreedt. Met behulp van deze gewijzigde DNA-sequentie is het fabricageproces vergelijkbaar met het beschreven recombinant-DNA-proces.

Kwaliteitscontrole

Na het synthetiseren van de humane insuline worden de structuur en zuiverheid van de insulinebatches getest via verschillende methoden. Hogedrukvloeistofchromatografie wordt gebruikt om te bepalen of er onzuiverheden in de insuline zitten. Andere scheidingstechnieken, zoals röntgenkristallografie, gelfiltratie en aminozuursequencing, worden ook uitgevoerd. Fabrikanten testen ook de verpakking van de flacon om er zeker van te zijn dat deze goed is afgesloten.

De productie van humane insuline moet voldoen aan de procedures van de National Institutes of Health voor grootschalige operaties. De Amerikaanse Food and Drug Administration moet alle geproduceerde insuline goedkeuren.

De Toekomst

De toekomst van insuline biedt vele mogelijkheden. Omdat insuline voor het eerst werd gesynthetiseerd, moesten diabetici de vloeibare insuline regelmatig met een injectiespuit rechtstreeks in hun bloedbaan injecteren. Hierdoor kan de insuline direct in het bloed komen. Jarenlang was het de enige bekende manier om het intacte insuline-eiwit in het lichaam te krijgen. In de jaren negentig begonnen onderzoekers door te dringen in het synthetiseren van verschillende apparaten en vormen van insuline die diabetici kunnen gebruiken in een alternatief medicijnafgiftesysteem.

Fabrikanten produceren momenteel verschillende relatief nieuwe apparaten voor het afleveren van medicijnen. Insulinepennen zien eruit als een schrijfpen. Een patroon bevat de insuline en de punt is de naald. De gebruiker stelt een dosis in, steekt de naald in de huid en drukt op een knop om de insuline te injecteren. Met pennen is het niet nodig om een ​​injectieflacon insuline te gebruiken. Bij pennen moeten echter vóór elke injectie afzonderlijke tips worden ingebracht. Een ander nadeel is dat gebruikers met de pen geen insulinetypen kunnen mengen en dat niet alle insuline beschikbaar is.

Voor mensen die een hekel hebben aan naalden is een alternatief voor de pen de jet-injector. Jet-injectoren lijken op de pennen en gebruiken druk om een ​​kleine stroom insuline door de huid te stuwen. Deze apparaten worden niet zo veel gebruikt als de pen en kunnen blauwe plekken veroorzaken bij het invoerpunt.

De insulinepomp zorgt voor een gecontroleerde afgifte in het lichaam. Dit is een computergestuurde pomp, ongeveer zo groot als een pieper, die diabetici aan hun riem of in hun zak kunnen dragen. De pomp heeft een kleine flexibele buis die net onder het oppervlak van de huid van de diabeticus wordt ingebracht. De diabeticus stelt de pomp in om gedurende de dag een constante, afgemeten dosis insuline af te geven, waarbij de hoeveelheid vlak voor het eten wordt verhoogd. Dit bootst de normale afgifte van insuline door het lichaam na. Fabrikanten hebben sinds de jaren tachtig insulinepompen geproduceerd, maar door de vooruitgang aan het eind van de jaren negentig en het begin van de eenentwintigste eeuw zijn ze steeds gebruiksvriendelijker en populairder geworden. Onderzoekers onderzoeken de mogelijkheid van implanteerbare insulinepompen. Diabetici zouden deze apparaten bedienen via een externe afstandsbediening.

Onderzoekers onderzoeken andere opties voor het toedienen van medicijnen. Insuline opnemen via pillen is een mogelijkheid. De uitdaging met eetbare insuline is dat de hoge zure omgeving van de maag het eiwit vernietigt voordat het in het bloed kan komen. Onderzoekers werken aan het omhullen van insuline met plastic ter breedte van een paar mensenhaar. De omhulsels zouden de medicijnen beschermen tegen het maagzuur.

In 2001 vinden er veelbelovende tests plaats op apparaten voor insuline voor inhalatie en fabrikanten zouden de producten binnen de komende jaren kunnen gaan produceren. Omdat insuline een relatief groot eiwit is, dringt het niet door in de longen. Onderzoekers van geïnhaleerde insuline werken aan het creëren van insulinedeeltjes die klein genoeg zijn om de diepe long te bereiken. De deeltjes kunnen dan in de bloedbaan terechtkomen. Onderzoekers testen verschillende inhalatieapparaten die lijken op die van een astma-inhalator.

Een andere vorm van aërosol die tests ondergaat, zal insuline toedienen aan de binnenkant van de wang. Bekend als buccale (wang) insuline, zullen diabetici de insuline op de binnenkant van hun wang spuiten. Het wordt vervolgens geabsorbeerd door de binnenste wangwand.

Insulinepleisters zijn een ander medicijnafgiftesysteem in ontwikkeling. Patches zouden continu insuline in de bloedbaan afgeven. Gebruikers zouden aan een lipje op de pleister trekken om meer insuline af te geven voor de maaltijd. De uitdaging is om een ​​manier te vinden om insuline door de huid te laten gaan. Echografie is een methode die onderzoekers onderzoeken. Deze laagfrequente geluidsgolven kunnen de doorlaatbaarheid van de huid veranderen en insuline doorlaten.

Ander onderzoek heeft het potentieel om de noodzaak voor fabrikanten om insuline te synthetiseren te beëindigen. In het laboratorium werken onderzoekers aan het maken van de cellen die insuline produceren. De gedachte is dat artsen op een dag de niet-werkende alvleeskliercellen kunnen vervangen door insulineproducerende cellen. Een andere hoop voor diabetici is gentherapie. Wetenschappers werken aan het corrigeren van de mutatie van het insulinegen, zodat diabetici zelf insuline kunnen produceren.

Waar meer te leren

Boeken

Clark, David P en Lonnie D. Russell. Moleculaire biologie eenvoudig en leuk gemaakt. 2e ed. Wenen, IL:Cache River Press, 2000.

Considine, Douglas M., uitg. De wetenschappelijke encyclopedie van Van Nostrand. 8e druk. New York:International Thomson Publishing Inc., 1995.

Tijdschriften

Dinsmoor, Robert S. "Insuline:een oneindige evolutie." Aftellen (voorjaar 2001).

Overige

Diabetes Digest-webpagina. 15 november 2001. .

Ontdekking van insuline-webpagina. 16 november 2001. .

Eli Lilly Corporation. Humuline- en Humalog-ontwikkeling. CD-ROM, 2001.

Eli Lilly Diabetes-webpagina. 16 november 2001. .

Novo Nordisk Diabetes webpagina. 15 november 2001. .

M. Rae Nelson