DNA-synthese

Achtergrond

Desoxyribonucleïnezuursynthese (DNA) is een proces waarbij kopieën van nucleïnezuurstrengen worden gemaakt. In de natuur vindt DNA-synthese in cellen plaats door een mechanisme dat bekend staat als DNA-replicatie. Met behulp van genetische manipulatie en enzymchemie hebben wetenschappers door de mens gemaakte methoden ontwikkeld voor het synthetiseren van DNA. De belangrijkste hiervan is de polymerasekettingreactie (PCR). PCR werd voor het eerst ontwikkeld in het begin van de jaren tachtig en is een miljardenindustrie geworden, waarbij het oorspronkelijke patent werd verkocht voor $ 300 miljoen dollar.

Geschiedenis

DNA werd in 1951 ontdekt door Francis Crick, James Watson en Maurice Wilkins. Met behulp van röntgenkristallografiegegevens die zijn gegenereerd door Rosalind Franklin, bepaalden Watson en Crick dat de structuur van DNA die van een dubbele helix was. Voor dit werk ontvingen Watson, Crick en Wilkins in 1962 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde. In de loop der jaren hebben wetenschappers met DNA gewerkt om de 'code van het leven' te achterhalen. Ze ontdekten dat DNA diende als instructiecode voor eiwitsequenties. Ze ontdekten ook dat elk organisme een unieke DNA-sequentie heeft en dat deze kan worden gebruikt voor screening, diagnostische en identificatiedoeleinden. Een ding dat in deze onderzoeken beperkend bleek te zijn, was de hoeveelheid DNA die beschikbaar was uit één enkele bron.

Nadat de aard van het DNA was bepaald, konden wetenschappers de samenstelling van de cellulaire genen onderzoeken. Een gen is een specifieke sequentie van DNA-basenparen die de code vormen voor de constructie van een eiwit. Deze eiwitten bepalen de eigenschappen van een organisme, zoals oogkleur of bloedgroep. Toen een bepaald gen werd geïsoleerd, werd het wenselijk om kopieën van dat molecuul te synthetiseren. Een van de eerste manieren waarop een grote hoeveelheid van een specifiek DNA werd gesynthetiseerd, was door middel van genetische manipulatie.

Genetische manipulatie begint door een gen van belang te combineren met een bacterieel plasmide. Een plasmide is een klein stukje DNA dat in veel bacteriën wordt aangetroffen. Het resulterende hybride DNA wordt recombinant DNA genoemd. Dit nieuwe recombinante DNA-plasmide wordt vervolgens in bacteriële cellen geïnjecteerd. De cellen worden vervolgens gekloond door ze in een kweek te laten groeien en zich te vermenigvuldigen. Naarmate de cellen zich vermenigvuldigen, doen ook kopieën van het ingevoegde gen zich vermenigvuldigen. Als de bacterie zich voldoende heeft vermenigvuldigd, kunnen de meerdere exemplaren van het ingebrachte gen worden geïsoleerd. Deze methode van DNA-synthese kan in een paar weken miljarden kopieën van een gen produceren.

In 1983 werd de tijd die nodig was om kopieën van DNA te maken aanzienlijk verminderd toen Kary Mullis een proces ontwikkelde voor het synthetiseren van DNA, de zogenaamde polymerasekettingreactie (PCR). Deze methode is veel sneller dan eerdere bekende methoden die in slechts een paar uur miljarden kopieën van een DNA-streng produceren. Het begint met het plaatsen van een klein stukje dubbelstrengs DNA in een oplossing die DNA-polymerase, nucleotiden en primers bevat. De oplossing wordt verwarmd om de DNA-strengen te scheiden. Wanneer het wordt afgekoeld, maakt het polymerase een kopie van elke streng. Het proces wordt elke vijf minuten herhaald totdat de gewenste hoeveelheid DNA is geproduceerd. In 1993 leverde Mullis' ontwikkeling van PCR hem de Nobelprijs voor Scheikunde op. Tegenwoordig heeft PCR een revolutie teweeggebracht op het gebied van medische diagnostiek, forensisch onderzoek en microbiologie. Het zou een van de belangrijkste ontwikkelingen in genetisch onderzoek zijn.

Achtergrond

De sleutel tot het begrijpen van DNA-synthese is het begrijpen van de structuur ervan. DNA is een polymeer met lange keten dat bestaat uit chemische eenheden die nucleotiden worden genoemd. Ook bekend als genetisch materiaal, is DNA het molecuul dat informatie bevat die de eiwitsynthese in de meeste levende organismen dicteert. Gewoonlijk bestaat DNA als twee ketens van chemisch gekoppelde nucleotiden. Deze koppelingen volgen specifieke patronen die worden bepaald door de regels voor basenparen. Elk nucleotide bestaat uit een deoxyribosesuikermolecuul, een fosfaatgroep en een van de vier stikstofbevattende basen. De basen omvatten de pyrimidinen thymine (T) en cytosine (C) en de purines adenine (A) en guanine (G). In DNA verbindt adenine zich over het algemeen met thymine en guanine met cytosine. Het molecuul is gerangschikt in een structuur die een dubbele helix wordt genoemd en die kan worden voorgesteld door een gedraaide ladder of wenteltrap voor te stellen. De bases vormen de sporten van de ladder, terwijl de suiker- en fosfaatdelen de ladderzijden vormen. De volgorde waarin de nucleotiden zijn gekoppeld, de sequentie genoemd, wordt bepaald door een proces dat bekend staat als DNA-sequencing.

In een eukaryote cel vindt DNA-synthese plaats net voor de celdeling via een proces dat replicatie wordt genoemd. Wanneer de replicatie begint, worden de twee DNA-strengen gescheiden door een verscheidenheid aan enzymen. Zo geopend, dient elke streng als een sjabloon voor het produceren van nieuwe strengen. Dit hele proces wordt gekatalyseerd door een enzym dat DNA-polymerase wordt genoemd. Dit molecuul brengt overeenkomstige of complementaire nucleotiden in lijn met elk van de DNA-strengen. De nucleotiden worden vervolgens chemisch gekoppeld om nieuwe DNA-strengen te vormen die exacte kopieën zijn van de originele streng. Deze kopieën, de dochterstrengen genoemd, bevatten de helft van het oorspronkelijke DNA-molecuul en de helft van een geheel nieuw molecuul. Replicatie met deze methode staat bekend als semiconservatieve replicatie. Het proces van replicatie is belangrijk omdat het een methode biedt voor cellen om een ​​exact duplicaat van hun genetisch materiaal over te dragen van de ene generatie cel naar de volgende.

Grondstoffen

De primaire grondstoffen die worden gebruikt voor DNA-synthese omvatten DNA-uitgangsmaterialen, taq DNA-polymerase, primers, nucleotiden en de bufferoplossing. Elk van deze speelt een belangrijke rol bij de productie van miljoenen DNA-moleculen.

Gecontroleerde DNA-synthese begint met het identificeren van een klein stukje DNA dat moet worden gekopieerd. Dit is typisch een specifieke DNA-sequentie die de code voor een gewenst eiwit bevat. Dit materiaal wordt template-DNA genoemd en is nodig in concentraties van ongeveer 0,1-1 microgram. Het moet in hoge mate worden gezuiverd omdat zelfs sporenhoeveelheden van de verbindingen die worden gebruikt bij DNA-zuivering het PCR-proces kunnen remmen. Een methode voor het zuiveren van een DNA-streng is het behandelen met 70% ethanol.

Hoewel het proces van DNA-replicatie vóór 1980 bekend was, was PCR niet mogelijk omdat er geen hittestabiele DNA-polymerasen bekend waren. DNA-polymerase is het enzym dat de reacties katalyseert die betrokken zijn bij de DNA-synthese. In het begin van de jaren tachtig ontdekten wetenschappers bacteriën die rond natuurlijke stoomopeningen leefden. Het bleek dat deze organismen, genaamd thermus aquaticus, had een DNA-polymerase dat stabiel en functioneel was bij extreme hitte. Deze taq DNA-polymerase werd de hoeksteen voor moderne DNA-synthesetechnieken. Tijdens een typisch PCR-proces, 2-3 microgram taq DNA-polymerase is nodig. Als er echter te veel wordt gebruikt, kunnen ongewenste, niet-specifieke DNA-sequenties het gevolg zijn.

Het polymerase bouwt de DNA-strengen op door overeenkomstige nucleotiden op elke DNA-streng te combineren. Chemisch gezien zijn nucleotiden opgebouwd uit drie soorten moleculaire groepen, waaronder een suikerstructuur, een fosfaatgroep en een cyclische base. Het suikergedeelte vormt de primaire structuur voor alle nucleotiden. Over het algemeen zijn de suikers samengesteld uit vijf koolstofatomen waaraan een aantal hydroxy (-OH) groepen is bevestigd. Voor DNA is de suiker 2-deoxy-D-ribose. Het bepalende deel van een nucleotide is de heterocyclische base die covalent aan de suiker is gebonden. Deze basen zijn ofwel pyrimidine- ofwel purinegroepen en vormen de basis voor de nucleïnezuurcode. Er worden twee soorten purinebasen gevonden, waaronder adenine en guanine. In DNA zijn twee soorten pyrimidinebasen aanwezig, thymine en cytosine. Een fosfaatgroep vormt het laatste deel van een nucleotide. Deze groep is afgeleid van fosforzuur en is covalent gebonden aan de suikerstructuur op het vijfde koolstofatoom.

De eerste fase van de polymerasekettingreactie (PCR) omvat de denaturatie van DNA. Dit "openen" van het DNA-molecuul levert de sjabloon voor het volgende DNA-molecuul waaruit het moet worden geproduceerd. Met het DNA opgesplitst in afzonderlijke strengen, wordt de temperatuur verlaagd - de primer-annealingsstap. Tijdens de volgende fase interageert het DNA-polymerase met de strengen en voegt complementaire nucleotiden over de gehele lengte toe. De benodigde tijd in deze fase is ongeveer één minuut voor elke 1000 basenparen.

Om DNA-synthese te initiëren, moeten korte primersecties van DNA worden gebruikt. Deze primersecties, oligofragmenten genoemd, zijn ongeveer 18-25 nucleotiden lang en komen overeen met een sectie op het matrijs-DNA. Ze hebben typisch een C- en G-nucleotideconcentratie van ongeveer 60% met een gelijkmatige verdeling. Dit zorgt voor de maximale efficiëntie in het syntheseproces.

De bufferoplossing levert het medium waarin DNA-synthese kan plaatsvinden. Dit is een waterige oplossing die MgCl2, HCI, EDTA en KCI bevat. De MgCl2-concentratie is belangrijk omdat de Mg2+-ionen interageren met het DNA en de primers, waardoor cruciale complexen voor DNA-synthese ontstaan. De aanbevolen concentratie is één tot vier micromol. De pH van dit systeem is van cruciaal belang, dus het kan ook worden gebufferd met ammoniumsulfaat. Om de reactie te activeren, worden verschillende energiemoleculen toegevoegd, zoals ATP, GTP en NTP. Deze verbindingen zijn dezelfde die levende organismen gebruiken om metabolische reacties te stimuleren.

Andere materialen die bij het proces kunnen worden gebruikt, zijn onder meer minerale olie of paraffinewas. Nadat de DNA-synthese is voltooid, wordt het DNA typisch geïsoleerd en gezuiverd. Enkele veel voorkomende reagentia die in dit proces worden gebruikt, zijn fenol, EDTA en proteïnase K.

Het fabricageproces

DNA-synthese wordt meestal op kleine schaal in laboratoria gedaan. Het omvat drie verschillende processen, waaronder monstervoorbereiding, DNA-synthesereactiecyclus en DNA-isolatie. Deze fabricagestappen worden doorgaans in aparte ruimtes uitgevoerd om besmetting te voorkomen. Door deze procedures te volgen, zijn wetenschappers in staat een paar strengen DNA om te zetten in miljoenen en miljoenen exacte kopieën.

Voorbereiding van de monsters

• 1 Om de DNA-synthese te starten, worden de verschillende oplossingen bereid. Dit wordt meestal gedaan in een kast met laminaire stroming die is uitgerust met een UV-lamp om verontreiniging tot een minimum te beperken. Wetenschappers gebruiken om soortgelijke redenen nieuwe handschoenen tijdens elke productiestap. Gewoonlijk worden alle startoplossingen behalve de primers, polymerasen en de dNTP's in een autoclaaf gedaan om elk verontreinigend organisme te doden. Er worden twee afzonderlijke oplossingen gemaakt. Eén bevat de buffer, primers en het polymerase. De andere bevat het MgCl2 en het template-DNA. Deze oplossingen worden allemaal in kleine buisjes gedaan om de reactie te starten.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis werd geboren in Lenoir, North Carolina, in 1944. Na zijn afstuderen aan Georgia Tech in 1966 met een B.S. in de chemie, Muilis ging de biochemie doctoraatsprogramma aan de Universiteit van Californië, Berkeley. Het behalen van zijn Ph.D. in 1973 aanvaardde hij een docentschap aan de University of Kansas Medical School in Kansas City. In 1977 aanvaardde hij een postdoctorale beurs aan de Universiteit van Californië, San Francisco.

Muilis aanvaardde in 1979 een baan als onderzoekswetenschapper bij een groeiend biotechbedrijf - Cetus Corporation in Emeryville, Californië - dat chemicaliën synthetiseerde die door andere wetenschappers werden gebruikt bij genetisch klonen. Terwijl hij daar was, ontwierp hij de polymerasekettingreactie (PCR), een snelle en effectieve techniek voor het reproduceren van specifieke genen of DNA-fragmenten (deoxyribonucleïnezuur), die in een paar uur miljarden kopieën kunnen maken. De meest effectieve manier om DNA te reproduceren was door te klonen, maar het was problematisch. Het kostte tijd om Mullis' collega's van het belang van deze ontdekking te overtuigen, maar al snel werd PCR het middelpunt van intensief onderzoek. Wetenschappers van Cetus ontwikkelden een commerciële versie van het proces en een machine genaamd de Thermal Cycler (met de toevoeging van de chemische bouwstenen van DNA [nucleotiden] en een biochemische katalysator [polymerase], zou de machine het proces automatisch uitvoeren op een doelstuk van DNA).

Cetus kende Muilis 10.000 dollar toe voor de ontwikkeling van het PCR-patent en verkocht het vervolgens voor 300 miljoen dollar. Muilis verliet Cetus in 1986 en werd een particuliere biochemische onderzoeksconsulent en ontving in 1993 de Nobelprijs.

DNA-synthesecyclus

• 2 Nadat de reagerende oplossingen zijn bereid, wordt de PCR-cyclus gestart. De eerste fase omvat de denaturatie van DNA. Een van de belangrijkste eerste stappen is de volledige denaturatie van de DNA-template. Denaturatie van het DNA betekent in wezen het uiteenvallen van de dubbel gebonden streng. Dit "openen" van het DNA-molecuul levert de sjabloon voor het volgende DNA-molecuul waaruit het moet worden geproduceerd. Een onvolledige denaturatie zal resulteren in een inefficiënte kopie in de eerste cyclus die een negatieve invloed heeft op elke volgende cyclus. De initiële denaturatie wordt gedaan door de DNA-matrijsoplossing gedurende één tot drie minuten op te warmen tot 203°F (95°C). De totale tijd is afhankelijk van de samenstelling van de sjabloon. In herhaalde cycli duurt de denaturatiestap ongeveer twee minuten en omvat het verwarmen van de oplossing tot 201PF (94°C). Extra materialen kunnen aan de oplossing worden toegevoegd om DNA-denaturatie te vergemakkelijken, zoals glycerol, DMSO of formamide.
• 3 Met het DNA gesplitst in afzonderlijke strengen, wordt de temperatuur verlaagd tot 122-149°F (50-65°C). Dit staat bekend als de primer-gloeistap en duurt ongeveer twee minuten. Op dit punt komen de linker- en rechterprimers overeen en verbinden ze chemisch met hun complementaire basen op het sjabloon-DNA.
• 4 De volgende fase betreft de verlengingsstap. Dit deel van de reactie is wanneer het grootste deel van de DNA-streng wordt gekopieerd. De temperatuur van het systeem wordt verwarmd tot ongeveer 162 °F (72°C) en daar gehouden, afhankelijk van de lengte van het te kopiëren DNA. In dit stadium interageert het DNA-polymerase met de strengen en voegt complementaire nucleotiden over de gehele lengte toe. De benodigde tijd in deze fase is ongeveer één minuut voor elke 1000 basenparen.
• 5 Na deze eerste cyclus wordt de DNA-synthesecyclus herhaald. Het aantal cycli hangt af van de hoeveelheid aanvankelijk DNA en de gewenste hoeveelheid DNA. Als er minder dan 10 kopieën van het matrijs-DNA beschikbaar zijn, zijn 40 cycli nodig. Met meer initieel DNA zijn 25-30 cycli voldoende.
• 6 Tijdens de laatste cyclus wordt het monster ongeveer 15 minuten op 162 °F (72 °C) gehouden. Hierdoor kunnen eventuele uitstekende uiteinden van een nieuwe DNA-streng worden ingevuld (met nucleotiden). In dit stadium voegt het polymerase extra A-nucleotiden toe aan het ene uiteinde van de DNA-strengen.

DNA-isolatie

• 7 Wanneer de reacties zijn voltooid, wordt het DNA geïsoleerd uit de PCR-reagerende materialen zoals het DNA-polymerase, MgCl2 en de primers. Dit wordt gedaan door het toevoegen van verbindingen zoals fenol, EDTA en Proteinase K. Centrifugatie is ook nuttig in dit opzicht.

De Toekomst

Hoewel wetenschappers PCR regelmatig gebruiken voor DNA-synthese, is er nog veel dat niet wordt begrepen over DNA-replicatie. In de toekomst moet onderzoek de details van een aantal belangrijke stappen van het proces ophelderen, zoals de componenten en tussenproducten. Bovendien kunnen verbeterde polymerasen worden ontwikkeld, waardoor het mogelijk wordt om meer DNA te maken uit kleinere uitgangsmonsters. Het is te hopen dat DNA-synthese op een dag zal helpen om enkele van de belangrijkste aspecten van levende organismen te ontsluiten en zal leiden tot de ontwikkeling van medicijnen die verschillende kankers, virale en bacteriële infecties zullen genezen.