Bioveiligheid en antibacterieel vermogen van grafeen en grafeenoxide in vitro en in vivo

Abstract

In de afgelopen jaren zijn grafeen (G) en grafeenoxide (GO) nanodeeltjes begonnen te worden toegepast bij het modificeren van chirurgische implantaten. De bioveiligheid en het antibacteriële vermogen van G en GO zijn echter nog steeds onduidelijk. In deze studie werd de bioveiligheid van G en GO in vitro geëvalueerd door co-cultuur met mesenchymale beenmergstamcellen (BMSC's) en bioveiligheid in vivo werd waargenomen door materialen in spierweefsel van muizen te implanteren. Uit bioveiligheidsresultaten bleek dat 10 μg/ml de veiligheidskritieke concentratie was voor G en GO. Wanneer de concentratie meer dan 10 μg/ml was, vertoonde de cytotoxiciteit van G en GO een dosisafhankelijke manier.

Antibacteriële resultaten toonden aan dat G het antibacteriële vermogen vertoonde met een concentratie gelijk aan en meer dan 100 μg/ml; GO presenteerde het antibacteriële vermogen met een concentratie gelijk aan en meer dan 50 μg/ml. Het antibacteriële effect van G en GO was in vitro dosisafhankelijk.

De GO- of G-concentratie tussen 50 en 100 μg/ml kan het beste bereik zijn om de balans tussen cytotoxiciteit en antibacterieel vermogen te behouden. Onze studie laat zien dat G en GO potentieel hebben om in de kliniek te worden gebruikt met goede bioveiligheid en antibacteriële eigenschappen in een bepaald concentratiebereik.

Achtergrond

In de afgelopen jaren worden chirurgische implantaten veel gebruikt om botbreuken en andere ziekten te behandelen, maar het implantaat heeft zowel goede bioveiligheid als antibacteriële eigenschappen nodig om afstoting en infectie te voorkomen. In feite is de orthopedische behandeling van infectieus botdefect nog steeds een groot probleem. Wat betreft bacteriën, Staphylococcus aureus is de meest voorkomende ziekteverwekker in orthopedie en orthopedische implantaten [1]. Door botdefecten en infectie [2] is de behandeling moeilijk en hebben patiënten veel tijd nodig om te genezen. Als de wond niet geneest, is amputatie van ledematen de laatste behandeling [3, 4].

Een goede behandeling van infectief botdefect moet tegelijkertijd voldoen aan zowel infectiebeheersing als reconstructie van het herstelverzoek voor botdefecten. Met de ontwikkeling van bone tissue engineering worden steeds meer toepassingen van biomateriaal gebruikt op het gebied van orthopedische behandelingen. Het genezingspercentage van infectie in de botten kan daarom sterk worden verbeterd. Deze materialen omvatten voornamelijk heterogeen bot [5], biokeramiek [6] (zoals hydroxyapatiet [7] en calciumfosfaat [8]), polymeren [9, 10], eiwitmaterialen (zoals collageenvezels [11]), enzovoorts. Naast deze materialen hebben Beatriz Pelaz et al. onthulde het belang en het veelbelovende perspectief van nanotechnologie in implantaten [12]; onder deze nanodeeltjes zijn grafeen en zijn derivaten andere nieuwe materialen om te voldoen aan de vereisten voor botherstel.

Grafeen is tweedimensionaal, met een enkele of enkele lagen koolstofatomen in een honingraatstructuur [13,14,15]. Het wordt veel gebruikt in composietmaterialen [16, 17], sensoren [18, 19], energie [16, 20] en andere gebieden vanwege de uitstekende fysieke eigenschappen. Grafeenoxide is een aan het oppervlak gefunctionaliseerd grafeenmateriaal dat zich in een laag koolstofatomen bevindt die is verbonden met een tweedimensionale oneindige uitbreiding van de basisoppervlakte-actieve groepen die zuurstof en zijn grafeenoxidevorm bevatten [21]. Grafeen (G) en zijn derivaten hebben op biomedisch gebied tot grote bezorgdheid geleid vanwege de unieke tweedimensionale structuur en de specifieke fysische en chemische eigenschappen [22]. Gefunctionaliseerd grafeen en zijn derivaten hebben veel functies, zoals het laden van medicijnen [23], antibacterieel [24], bio-imaging [25, 26] en kankertherapie [27].

Over het aspect van antimicrobiële capaciteit, Li et al. onthulde dat het antimicrobiële mechanisme van G voornamelijk wordt veroorzaakt door ladingsoverdracht [28] en bacteriële migratie. Bacteriën worden overgebracht naar het oppervlak van scherpe nanosheets, die bacteriën verscheuren door de scherpe randen [29]. Bovendien, Tu et al. toonde ook een ander potentieel antimicrobieel mechanisme aan dat G in de cellen kan doordringen, wat leidt tot de extractie van grote hoeveelheden fosfolipiden uit de celmembranen [30]. Zo hebben G en grafeenoxide (GO) bioactiviteit en antimicrobiële capaciteit, wat voldoet aan de vereisten om te worden gekwalificeerd als botherstellende materialen.

Bij grootschalige productie en toepassing zijn de bioveiligheidsproblemen van grafeen echter bijzonder belangrijk. Werknemers kunnen last hebben van blootstelling aan nanodeeltjes (NP's) via meerdere media, waaronder inademing, contact via de huid en gastro-enterische routes. Andrea Prodi et al. stelde een stapsgewijze benadering voor om NP-blootstelling te beoordelen voor verdere bescherming [31]. Behalve voor beoordeling zijn bioveiligheid en biocompatibiliteit andere belangrijke onderzoekspunten. Kan Wang et al. toonde de biocompatibiliteit aan van GO, dat toxiciteit vertoont voor menselijke fibroblastcellen wanneer de dosis lager is dan 20 g/ml, maar duidelijke cytotoxiciteit vertoont wanneer de dosis hoger is dan 50 μg/ml, met een significant verminderde celadhesie [32]. Op dit moment bevestigt een meer consistent beeld dat G en GO een toxisch effect hebben op bacteriën, maar op gespannen voet staan met het toxische effect op cellen [33,34,35,36]. De functie en toxiciteit van G en GO moet nog specifieker worden onderzocht. Beatriz Pelaz et al. stelde een vraag:"hoe risico's kunnen worden verminderd en voordelen kunnen worden vergroot, zijn van vitaal belang voor de ontwikkeling van veilige en effectieve nanomedicijnen", wat de studie herinnert aan en aanspoort tot een combinatie van de potentiële risico's van G en GO en het antibacteriële vermogen in vivo en in vitro [12] .

Beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSC's) zijn multipotente volwassen stamcellen. Ze zijn een belangrijke celbron geworden voor het repareren van botdefecten bij weefselmanipulatie [37, 38]. Bovendien ontbreekt nog onderzoek naar de interactie tussen grafeen en derivaten en stamcellen [39, 40].

Daarom onderzocht deze studie het effect van G en GO op BMSC's in vitro muizen spierweefsel, Staphylococcus aureus , met als doel de cytotoxiciteit en het antibacteriële vermogen van G en GO in vivo en in vitro te onderzoeken en het onderzoek naar nanomedicine en nanotoxiciteit van koolstof nanomateriaal te bevorderen.

Resultaten

G- en GO-cytotoxiciteit

G- en GO-cytotoxiciteit in vitro

Onder de elektronenmicroscoop vertoonden G- of GO-nanodeeltjes een onregelmatige vorm met de grootte van 30,41 ± 5,59 nm, en deeltjesagglomeratie kon worden gevonden (Fig. 1a, b). Na 7 dagen kweken werd de morfologie van de cel veranderd in spilvorm (figuur 1c). Calciumknobbeltjes werden gevormd na kweek met osteogeen differentiatiemedium (figuur 1d). Olieophoping werd gevormd na adipogene differentiatie (Fig. 1e).

G- en GO-cytotoxiciteit (a , b). TEM-afbeeldingen van G (a ) en GO (b ) toonde het gevormde nanonetwerk. c Cytomorfologie van BMSC's. d Alizarine rood voor calciumafzetting. e Olie rood O voor lipiden. v Celactiviteit na behandeling met G en GO, *P <0,01 met controlegroep, ^# P <0,01 met controlegroep, ^○ P <0,05 met G 50 μg/ml-groep, ^{☆, □, △} P <0,01 met dezelfde concentratie van de G-groep. r 2 (G) =0,843, r 2 (GO) =0,939. Schaalbalken a , b 200 nm, c , d 100 m, e 50 urn. r , correlatiecoëfficiënt

Wanneer de concentratie hoger was dan 10 g/ml, remde G of GO de groei van BMSC's. De cytotoxiciteit was het hoogst in de 1000 g/ml-groep en vertoonde de dosisafhankelijke wijze. Wanneer de concentratie hoger was dan 10 g/ml, was de cytotoxiciteit van de GO-groep hoger dan die van de G-groep bij dezelfde concentratie. Het verschil was significanter naarmate de concentratie toenam (Fig. 1f).

Onder observatie van SEM, toen de concentratie van G of GO 10 g / ml was, waren BMSC's in goede staat met goede hechting en vorm. Wanneer de concentratie van G meer dan 50 g/ml was, bleken de cellen te veranderen, waaronder een afname van de grootte, een toename van de secretie van het oppervlak en een verlenging van de microvillus op het celoppervlak. Toen de concentratie van GO meer dan 50 g/ml was, werden BMSC's gekrompen en vervormd gevonden en waren de meeste cellen dood. Deze resultaten gaven aan dat GO een hogere cytotoxiciteit had voor BMSC's in vergelijking met G onder dezelfde concentratie (Fig. 2).

SEM-afbeeldingen van co-cultuur van G, GO en BMSC's. een G-groep, 10 g/ml. De cellen zijn in goede staat. b G-groep, 50 g/ml. De celgrootte neemt af, de secretie van het oppervlak neemt toe en de microvillus op het celoppervlak wordt lang. c GO-groep, 50 g/ml. BMSC's krimpen en vervormen. G grafeen, GO grafeenoxide, B BMSC's

Onder observatie van TEM ontdekten we dat G of GO in BMSC's konden komen en zich op de interne cel konden afzetten. En toen de concentratie meer dan 50 μg/ml was, werden veranderingen in de cellulaire micro-omgeving gevonden, waaronder celstructuurstoornis en microvillus-rommel, wat wijst op de hogere cytotoxiciteit van GO in vergelijking met de G-groep (Fig. 3).

TEM-afbeeldingen van co-cultuur van G, GO en BMSC's. een G-groep. b GO-groep. Zowel G als GO kunnen leiden tot wanorde in de celstructuur en microvillus-rommel op het celoppervlak; GO veroorzaakt hoge cytotoxiciteit cellulaire micro-omgevingsveranderingen

Op basis van het resultaat van SEM- en TEM-observatie vonden we dat 10 μg/ml de veiligheidskritische concentratie was voor G en GO. Wanneer de concentratie van GO meer dan 10 g/ml was, had GO een hogere cytotoxiciteit voor BMSC's in vergelijking met G.

G- en GO-cytotoxiciteit in vivo

Om de G- en GO-cytotoxiciteit in vivo te analyseren, selecteren we skeletweefsel om lokale transplantatieomstandigheden in de orthopedie weer te geven en te simuleren. Het resultaat van HE-kleuring van skeletweefsel in de controlegroep en de G-groep vertoonde de normale structuur met spiermyofibrillen parallel aan de verticale as. In dwarsdoorsnede bevond de myofibrillaire sectie, gepresenteerd als de dunne vlekken en kern, zich aan de rand van cellen. De bovengenoemde veranderingen kunnen ook worden gevonden in normale skeletcellen, wat aangeeft dat G weinig toxiciteit heeft voor spierweefsel.

Integendeel, in de GO-groep waren transversale lijnen van de spiervezels in de lengtedoorsnede gebroken en niet duidelijk, wat de atrofie en necrose van de spier onthulde. GO had dus een hogere toxiciteit voor dieren (Fig. 4).

Weefselsecties gekleurd met HE-kleuring. een Controle vertegenwoordigt ongedeerd weefsel. b G-groep. Skeletcellen aanwezig als de rechte strook. Myofibrillen van de spieren zijn parallel langs de lange as, transversale lijnen zijn duidelijk en de dwarsdoorsnede is onregelmatige blokken. Myofibrillaire sectie presenteert zich als de dunne vlekken; kern bevindt zich aan de rand. c GO-groep. Dwarslijnen van de spiervezels in langsdoorsnede zijn gebroken en niet duidelijk

G en GO antibacteriële eigenschappen

Antibacteriële capaciteit in vitro

In het bacteriostase-experiment in vitro vertoonde de fotonintensiteit van de ROI van G of GO een dosisafhankelijke manier. En de fotonintensiteit nam af naarmate de concentratie toenam. In vergelijking met de G-groep bij dezelfde concentratie had de GO-groep een lagere fotonintensiteit (Fig. 5).

Intensiteitsbewaking van bioluminescentie van S . aureus in vitro. G en GO tonen een dosisafhankelijke manier in antibacterieel vermogen in vitro. een Bioluminescentie van Xen-29 in vitro afgebeeld na 0, 8 en 24 uur incubatie bij 37 °C, met kleurvariaties die de lichtintensiteit vertegenwoordigen (Bin M(8), FOV12, f1, 15 s). b PI =0 u, r 2 (GO-0 u) =0,924. c PI =8 uur, r 2 (G-8 h) =0,584, r 2 (GO-8 uur) =0,960. d PI =24 uur, r 2 (G-24 u) =0,616, r 2 (GO-24 uur) =0,943.*P <0,01 met controlegroep, ^# P <0,01 met controlegroep, ^{☆, □, △, ○} P <0,01 met dezelfde concentratie van de G-groep. r , correlatiecoëfficiënt

Op 0, 8 en 24 uur, toen de concentraties van G 100, 500 en 1000 g/ml waren, vertoonde G het remmingsvermogen naar Xen-29-groei in vergelijking met de controlegroep. De fotonenintensiteit in groepen van 10 en 50 g/ml vertoonde echter geen significant verschil met de controlegroep.

Wanneer de concentraties van GO 50, 100, 500 en 1000 g/ml waren, na 0, 8 en 24 uur, vertoonde GO het effect van groeiremming op Xen-29. Evenzo vertoonde de fotonenintensiteit in groepen van 10 en 50 g/ml geen statistisch significant verschil met de controlegroep.

De resultaten toonden aan dat de G het antibacteriële vermogen presenteerde met een concentratie van meer dan 100 g/ml, en GO het antibacteriële vermogen presenteerde met een concentratie van meer dan 50 g/ml. Het antibacteriële vermogen van G of GO was dosisafhankelijk. GO had een sterker antibacterieel vermogen vergeleken met G bij dezelfde concentratie.

Antibacteriële mogelijkheid in vivo

In het bacteriostase-experiment in vivo vertoonde de GO-groep een significant lagere fotonintensiteit (PI) -waarde bij 0 en 24 uur. De PI-waarde was verlaagd in vergelijking met de G-groep en de controlegroep. De PI-waarde van de G-groep was echter niet statistisch significant verschillend in vergelijking met de controlegroep (Fig. 6). De resultaten toonden aan dat GO een sterk antibacterieel vermogen vertoonde, maar G vertoonde geen duidelijk antibacterieel vermogen in vivo bij een concentratie van 100 μg/ml.

Intensiteitsbewaking van bioluminescentie van S . aureus in levende lijve. GO toont een dosisafhankelijke manier in antibacterieel vermogen in vivo. een Bioluminescentie van Xen-29 in vivo afgebeeld na 0 en 24 uur incubatie, met kleurvariaties die de lichtintensiteit vertegenwoordigen (Bin M (8), FOV12, f1, 60 s). b PI =0 u, ^# P <0,01 met controlegroep. c PI =24 uur, ^# P <0,01 met controlegroep

Discussie

Met de ontwikkeling van tissue engineering wordt een toenemend aantal toepassingen van biomateriaal gebruikt op het gebied van orthopedische behandeling [41]. Voor biomaterialen is een goede bioveiligheid noodzakelijk. G en GO worden op medisch gebied veel gebruikt vanwege hun veiligheid en unieke fysische en chemische eigenschappen. Wat betreft het antibacteriële vermogen zijn G en GO de goede antibacteriële stoffen. De belangrijkste antibacteriële mechanismen zijn ladingsoverdracht [28, 29] en penetratie in de cellen [30]. Het antibacteriële vermogen van G en GO zou dus kunnen voldoen aan de vereisten voor botherstellende materialen onder de veilige bereiken.

In deze studie hebben we, om de bioveiligheidseigenschappen te identificeren, G- en GO-cytotoxisch effect op BMSC's waargenomen via SEM en TEM, en dit effect gepresenteerd als een dosisafhankelijke manier. Bovendien had GO een hoger cytotoxisch effect. Wat betreft antibacteriële eigenschappen, hebben we verder waargenomen dat G en GO antibacteriële eigenschappen hadden als een dosisafhankelijke manier, en het GO-effect was significant beter dan G in vivo. Concluderend kan een concentratie in het bereik van 50 tot 100 g/ml beter zijn om de balans te behouden tussen een klein cytotoxisch effect en een groot antibacterieel vermogen.

Dit onderzoek toonde aan dat zowel G als GO het cytotoxische effect hebben op BMSC's en skeletcellen en dat de GO-toxiciteit hoger is dan G. Een groot aantal onderzoeken heeft de G-nanoceltoxiciteit en de fysische en chemische eigenschappen van het materiaal (zoals grootte, vorm en oppervlaktefunctionele groepen) naar cellen [35, 42, 43]. Bovendien ontdekten onderzoekers dat ongerepte G cytotoxiciteit kan induceren door de uitputting van het mitochondriale membraanpotentieel (MMP) en de toename van intracellulaire reactieve zuurstofspecies (ROS) [12], waardoor apoptose wordt veroorzaakt door activering van de mitochondriale route [34, 44] . Maar het fenomeen dat de cytotoxiciteit van GO hoger is dan G kan verband houden met de groepen op het oppervlak van GO [45]. Onderzoekers hebben ontdekt dat de cytotoxiciteit van GO rechtstreeks verband houdt met het serumgehalte. HuW et al. toonde aan dat GO een sterke adsorptiecapaciteit heeft die serumeiwit zou kunnen adsorberen om eiwitinsluitsels te vormen [46], wat de hogere cytotoxische basis van GO aantoont in vergelijking met G. Onze experimenten bevestigden de hierboven genoemde conclusies. Bovendien is toxiciteit bij dieren een andere belangrijke indicator van de biologische veiligheidsevaluatie van G en GO. In deze studie werd een ernstige pathologische respons in spierweefsel gevonden in de GO-groep, wat wijst op een hogere toxiciteit in vergelijking met de G-groep.

Ten tweede zijn antibacteriële eigenschappen in lijn met G- en GO-dosisveranderingen; 50~100 g/ml GO-concentratie zou de biologische toxiciteit en het antibacteriële vermogen beter in evenwicht kunnen brengen. Onze studies toonden aan dat zowel de biologische toxiciteit als het antibacteriële vermogen aanwezig zijn als de dosisafhankelijke manier. Daarom kan een bepaald concentratiebereik het evenwicht bewaren tussen geringe biologische toxiciteit en groot antibacterieel vermogen.

De resultaten toonden aan dat zowel G als GO enige biologische toxiciteit hadden voor BMSC's en spierweefsels, maar in de GO-groep was het antibacteriële vermogen significant in vivo. Op basis van de eerdere resultaten van G- en GO-toxiciteit, hebben we vastgesteld dat de concentratie van 50 ~ 100 g/ml de beste kan zijn om de balans te bewaren tussen kleine biologische toxiciteit en grote antibacteriële eigenschappen, waardoor nieuw bewijs wordt geleverd voor bioveiligheid en antibacteriële werking. vermogen van G en GO in vivo en in vitro in klinisch werk.

Hoewel GO veel toxische effecten heeft, kan de toxiciteit worden vermeden door modificaties van GO [47, 48]. Tegelijkertijd kunnen gemodificeerde GO-materialen worden afgebroken en in het lichaam worden uitgescheiden [49]; dus wordt dringend verzocht om een nieuwe onderzoeksrichting van de modificatie voor GO. Bovendien moeten effecten van G en GO op andere belangrijke organen of weefsels nog verder worden onderzocht om het holistische medicijn te bereiken. Ondertussen moet verder worden onderzocht of GO oxidatieve stressschade aan de bacteriën veroorzaakt en de aanwezigheid van een aanvullend antibacterieel mechanisme. Vóór de toepassing op weefselmanipulatie moeten de mechanismen van G- en GO-toxiciteit en gewijzigde manieren om de toxiciteit te verminderen nog meer worden verduidelijkt.

Methoden

Dieren

Mannelijke Sprague-Dawley (SD)-ratten en mannelijke Balb/C-muizen werden gekocht bij het Pasteur Institute of Iran en onder 12 uur licht/donker gehouden bij 25 °C. SD-ratten van 4 weken oud werden gebruikt voor isolatie van de BMSC's. Balb/C-muizen werden gebruikt voor dierproeven in vivo. Alle dieren werden grootgebracht in het Laboratory Animal Center van de Vierde Militaire Medische Universiteit en de operaties volgden de Animal Experimental Surgery Standard van het Xijing Hospital. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Vierde Militaire Medische Universiteit.

Grafeen en grafeenoxide

G of GO (lagen 1-2) (Hengqiu Graphene Technology, China) werd respectievelijk toegevoegd aan absolute ethanol (gebruikt voor transmissie-elektronenmicroscooptest, TEM), PBS-buffer (gebruikt voor in vitro celexperimenten) en zoutoplossing (gebruikt voor in vivo dierproeven) om de G- of GO-oplossing te bereiden (het Raman-spectroscopietestresultaat werd geleverd door Hengqiu Graphene Technology). De beginconcentratie van de G- of GO-oplossing was 1 mg/ml. G- of GO-oplossing werd 2 uur vóór de experimenten met ultrasoon gedispergeerd.

Cytotoxiciteit

Celcultuur

Het celkweekmedium bevatte 10% foetaal runderserum (Gibco, Carlsbad, Californië, VS), DMEM/F12 (Corning, NY, VS), 100 E/ml penicilline en 100 E/ml streptomycine (Sigma, St. Louis, Missouri, VS). BMSC's werden geëxtraheerd uit de 4 weken oude mannelijke ratten door de methode van beenmergkweek [50]. Na de executie van de rat werden het dijbeen en het scheenbeen onder aseptische omstandigheden verwijderd. Medullaire holte werd gewassen met celkweekmedium; vervolgens werd het mengsel gedurende 10 minuten onder 1500 rpm gecentrifugeerd om beenmerg te verzamelen. Beenmerg werd opnieuw gesuspendeerd met celkweekmedium en geënt in met gelatine beklede celkweekflessen bij 37 ° C en een incubator voor 5% koolstofdioxidecellen. Medium in celkweekflessen werd na 48 uur vervangen en niet-hechtende cellen werden verwijderd; vervolgens werd het kweekmedium eenmaal per 48 uur vervangen. Cellen van de derde tot vijfde passage werden gebruikt voor de volgende experimenten.

Osteogene differentiatie en adipogene differentiatie op BMSC's werden uitgevoerd met differentiatiemedium (Cyagen, CA, VS). Na 2 weken differentiatie-inductie werden cellen gedurende 30 minuten gefixeerd met 4% formaldehyde-oplossing; vervolgens werden alizarinerode kleuring voor osteogene differentiatie en olierode kleuring voor adipogene differentiatie uitgevoerd.

Celactiviteit

De BMSC-suspensieconcentratie werd aangepast tot 5 × l0⁴ / l en cellen werden gekweekt in een plaat met 96 gaten met 100 ul in elk gat. Na 24 uur werd het medium vervangen door celkweekmedium dat G of GO bevat met de concentraties 0 (als controlegroep), 10, 50, 100, 500 en 1000 g/ml. Na 24 uur kweken werd 10 μl alamarBlue (Bio-rad, Hercules, CA, VS) aan elk gat toegevoegd voor nog eens 4 uur cultuur. Microplaat (Bio-rad, Hercules, CA, VS) werd gebruikt om de OD-waarden (optische dichtheid) bij 570 en 600 nm te detecteren, en vervolgens werd de colorimetrische rekenmachine alamarBlue® (Bio-rad, Hercules, Californië, VS) gebruikt om evalueer de snelheid van celproliferatie.

Karakterisatie met SEM

BMSC's werden gezaaid in een 24-gaats dunne glasplaat met een dikte van 0,17 mm en een diameter van 14 mm. Na 24 uur kweken werd het medium vervangen door celkweekmedium dat G of GO bevatte met de concentraties van 0 (als controlegroep), 10, 50, 100, 500 en 1000 g/ml. De cellen werden gedurende 24 uur gekweekt en het supernatant werd daarna verwijderd. Cellen werden 24 uur gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde-oplossing. Vervolgens werden cellen na uitdroging en vergulding geobserveerd met een scanning-elektronenmicroscoop (Hitachi S-4800 SEM, JPN).

Karakterisatie met TEM

G- en GO-suspensie werden aangepast tot 50 g/ml. Cellen werden gedurende 24 uur samen met G of GO gekweekt en vervolgens verteerd door 0, 25% trypsine. Supernatant werd verwijderd na 10 minuten centrifugeren met 1000 rpm. Cellen werden 24 uur gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde-oplossing en plakjes werden waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie (FEI Tecnai G2 TEM, VS).

Toxiciteit en identificatie van spierweefsel

Om de G- en GO-cytotoxiciteit in vivo te analyseren, selecteren we skeletweefsel om lokale transplantatieomstandigheden in de orthopedie weer te geven en te simuleren. G of GO werd respectievelijk geïnjecteerd in de mediale femorale spierweefsels van Balb/C-muizen. Muizen werden na 7 dagen gedood en spierweefsel geïnjecteerd met G of GO werd 24 uur gefixeerd met 10% neutrale formaldehyde-oplossing. Na alcoholdehydratatie werd het weefsel in paraffine gewikkeld en in plakjes gesneden om hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring uit te voeren. Plakjes werden waargenomen onder omgekeerde microscoop (Leica DMI6000B omgekeerde microscoop, RBT).

Antibacteriële capaciteit

Bacteriële cultuur

We selecteerden Xen-29 om te kweken vanwege de luminescentiereactie. Xen-29 was een bioluminescente bacterie van Staphylococcus aureus (Caliper, LS, VS) afgeleid van ATCC-12600. Bacteriën werden gekweekt in Luria Bertani-medium (LB, Sigma, St. Louis, MO, VS) met 200 g / ml kanamycine (Sigma, St. Louis, MO, VS) bij 37 ° C. Een enkele kolonie werd genomen in LB-bouillon bij 37 ° C onder schudden gedurende 2-3 uur met een snelheid van 200 rpm. Toen de absorptie bij 600 nm 0,5 bereikte (ongeveer gelijk aan 1,44 x 108 cfu/ml) vergeleken met de absorptie in LB-bouillonblanco, werden de bacteriën gebruikt voor het volgende experiment.

Bioluminescente beeldvorming

Om bioluminescente beeldvorming te presenteren, gebruikten we IVIS Lumina II gekoeld CCD optisch macroscopisch beeldvormingssysteem (Caliper, LS, VS). Bacterieel bioluminescent signaal werd omgezet in fotonintensiteit (PI). Living Image® 4.2-software (Caliper, LS, VS) werd gebruikt voor kwantificering van PI in interessegebieden (ROI). Om beweging van de muizen in het beeldvormingsproces te voorkomen, werden muizen verdoofd om instabiliteit van het ontvangen signaal te voorkomen.

Antibacteriële capaciteit in vitro

Xen-29 werd toegevoegd aan de plaat met 24 gaten en de concentratie in elk gat was 10⁷ kvf. Vervolgens werd G- of GO-suspensie toegevoegd om de concentratie in te stellen op 0 (controle), 10, 50, 100, 500 en 1000 g/ml. Het constante volume in elk gat was 500 ul. Om het antibacteriële vermogen van G en GO te analyseren, werd de bacteriële PI in de ROI achtereenvolgens gemeten op 0, 8 en 24 uur na de interventie.

Antibacteriële mogelijkheid in vivo

Op basis van de bovenstaande experimentresultaten werd een groep van 100 g/ml gekozen om het antibacteriële vermogen te identificeren. Xen-29-suspensie (200 l) werd geïnjecteerd in de mediale femorale spierweefsels van Balb/C-muizen. PI van ROI werd gedetecteerd op 0 en 24 uur na de operatie.

Gegevensanalyse

Alle gegevens werden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Studenten t test werd gebruikt voor vergelijking tussen G en GO met dezelfde concentratie. Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) werd gebruikt om de verschillen tussen G en GO met respectievelijk verschillende concentraties te vergelijken. P <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Conclusies

Concluderend, G en GO hebben een biologisch cytotoxisch effect op de dosisafhankelijke manier. G en GO hebben antibacteriële eigenschappen en functioneren ook als de dosisafhankelijke manier; de GO antibacteriële eigenschappen zijn significant beter dan G in vivo. De concentratie van 50 ~ 100 g / ml kan beter zijn om de balans te bewaren tussen kleine biologische toxiciteit en groot antibacterieel vermogen. Bovendien moeten modificaties van GO om de toxiciteit te verminderen worden verduidelijkt om bij te dragen aan G- en GO-toepassingen in nanogeneeskunde.

Afkortingen

BMSC's:: Mesenchymale stamcellen uit beenmerg
G:: Grafeen
GO:: Grafeenoxide
HE:: Hematoxyline en eosine
LB:: Luria Bertani medium
NP's:: Nanodeeltjes
PI:: Fotonintensiteit
ROS:: Reactieve zuurstofsoorten
SEM:: Scanning elektronenmicroscoop
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie

Nieuwe biocompatibele Au Nanostars@PEG-nanodeeltjes voor in vivo CT-beeldvorming en eigenschappen voor nierklaring Effecten van dubbellaagse dikte op de morfologische, optische en elektrische eigenschappen van Al2O3/ZnO-nanolaminaten

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal