Remming van SARS-CoV-2 hoofdprotease

De ontwikkeling van een nieuw medicijn is een kostbaar en langdurig proces. Nu de wereld wordt geconfronteerd met een pandemie, is het dringend nodig om snel medicijnen te identificeren die de verspreiding van virussen stoppen. Herbestemming van geneesmiddelen biedt een aantrekkelijk alternatief voor dit langdurige proces door te proberen vast te stellen of een geneesmiddel waarvan bekend is dat het veilig is bij mensen, kan worden gebruikt om nieuwe ziekten te behandelen.

Hoewel het afzonderlijk gebruiken van dergelijke geherpositioneerde geneesmiddelen uiteindelijk geen significant klinisch voordeel oplevert, zou een zorgvuldige combinatie van geneesmiddelen die zich richten op verschillende eiwitten die cruciaal zijn voor virusreplicatie en -proliferatie, zeer effectief kunnen zijn, zoals het geval was met HIV in de jaren negentig. De dringende vraag is welke combinatie effectiever zou zijn?

Hier proberen we de structuur van de actieve site van SARS-CoV-2-protease te begrijpen, door deze te vergelijken met bestaande structuren van SARS-CoV-protease gecomplexeerd met micromolaire remmers, zodat we de belangrijkste interacties die nodig zijn om een ​​goede remmer te creëren beter kunnen begrijpen. voor SARS-CoV-2-protease.

Vervolgens hebben we een virtueel screeningsexperiment uitgevoerd met behulp van een bibliotheek van door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen om te zien of wordt voorspeld dat sommige van deze aan het protease binden. We hebben onderzocht hoe ze naar verwachting binden aan het SARS-CoV-2-protease en dus kunnen worden gebruikt in een combinatietherapie.

SARS-CoV-2-eiwitten

Het SARS-CoV-2-genoom van zieke patiënten werd snel geïsoleerd en gesequenced, wat de sequenties van mogelijke eiwitdoelen opleverde. Deze eiwitten delen een hoge sequentie-overeenkomst met SARS-CoV-eiwitten en aanvankelijk begonnen onderzoeksgroepen met het bouwen van homologiemodellen. Nu zien we steeds meer van deze experimenteel afgeleide (X-ray en Cryo-EM) structuren beschikbaar komen.

Een van de best gekarakteriseerde doelwitten voor geneesmiddelen onder coronavirussen is de belangrijkste protease:Mpro, ook wel 3CL-protease genoemd. ¹ Samen met de papaïne-achtige proteasen is dit enzym essentieel voor de verwerking van de polyproteïnen die worden getranslateerd uit het virale RNA. ² Het splitst de aminozuurruggengraat op 11 splitsingsplaatsen op het grote polyproteïne 1ab (Fig. 1).

Het remmen van de activiteit van dit enzym zou de virale replicatie blokkeren. Aangezien er geen menselijke proteasen met een vergelijkbare splijtingsspecificiteit bekend zijn, is het veel minder waarschijnlijk dat remmers van dit doelwit toxisch zijn en bijwerkingen veroorzaken.

Op structuur gebaseerd medicijnontwerp voor hergebruik van medicijnen:belangrijkste protease

Dit hoofdprotease is een homodimeer (Fig. 2) en elke subeenheid bevat een His41/Cys145 katalytische dyade.

SARS-CoV-2 deelt 96,1% identiteit en 99% gelijkenis met SARS-CoV-protease. (Fig. 3) Er is slechts één aminozuurverschil in de actieve plaats:residu 46 in SARS-CoV-2 is een serine in plaats van een alanine in SARS-CoV.

Er zijn veel structuren van SARS-CoV Mpro gecomplexeerd met liganden die beschikbaar zijn bij de PDB en de liganden met een micromolaire bindingsaffiniteit zijn allemaal covalente liganden.

De actieve plaatsen van de belangrijkste protease zijn sterk geconserveerd onder coronavirussen en zijn gewoonlijk samengesteld uit vier plaatsen (S1′, S1, S2 en S4) ³ (Fig. 4).

In het geval van PDB-structuren 2ZU4 en 2GX4 waarvoor liganden respectievelijk Ki-waarden van 0,038 M en 0,053 μM hebben, maakt de thiol van cysteïne 145 in de S1′-plaats contact met remmers met een covalente binding. In vergelijking met andere remmers met een lagere affiniteit lijkt dit belangrijk te zijn voor een hogere affiniteit.

Zorgvuldig onderzoek van hoe al deze liganden interageren met dit protease kan informatie opleveren over belangrijke interacties die moeten worden gecontroleerd bij het analyseren van koppelingsresultaten.

Virtuele screening

Profiteren van een hoge resolutie kristalstructuur van SARS-COV-2 protease dimeer in complex met een covalent gebonden peptide-achtige remmer N3 uitgebracht in februari (6LU7) ⁴ hebben we deze structuur gebruikt om een ​​virtueel screeningsexperiment uit te voeren. De remmer N3 die gecokristalliseerd is, bindt in de substraatbindende pocket in een verlengde conformatie. (Fig. 5)

We zijn begonnen met een bibliotheek met door de FDA goedgekeurde medicijnen met 2.684 verbindingen. We behielden verbindingen met een molecuulgewicht lager dan 800 kDa en voerden docking uit met GOLD van de CCDC. Later hebben we Binding Free Energies berekend met CHARMM en GBMV impliciet oplosmiddel. Voor elke pose hebben we eerst In Situ Ligand-minimalisatie uitgevoerd met een bol met een diameter van 14 Å voor residuflexibiliteit en geschatte ligandentropie bij het berekenen van de bindende vrije energie. De meeste van de gedokte verbindingen zijn bekende HCV- en HIV-proteasegeneesmiddelen. (Fig. 6)

Veel verbindingen maken contacten in de 4 subsites:S1, S'1, S2, S4 en sommige met zowel HIS 41 als CYS 145, vooral de HIV-proteaseremmers.

De best scorende verbinding is Troxerutine, een flavonoïde.

• Het is aangetoond dat flavonoïden sommige proteasen remmen ⁵ en onlangs IC₅₀ waarden werden berekend uit de dosisafhankelijke remmende curven van herbacetine, rhoifolin en pectolinarine op SARS-CoV. De gemeten waarden waren respectievelijk 33,17, 27,45 en 37,78 M.

Dipyridamol (Fig. 7), dat de vijfde gerangschikte verbinding is, is onlangs genoemd in een preprint Therapeutische effecten van dipyridamol op COVID-19-patiënten met stollingsdisfunctie, en er is aangetoond dat het HCoV-19-replicatie onderdrukt bij een EC50 van 100 nM in vitro.

Figuur 7 :3D-rendering en 2D-interactiekaart van dipyridamol in het hoofdprotease. Er zijn interacties met katalytische residuen aanwezig, en met enkele van de eerder genoemde residuen voor SARS-CoV-remmers.

Een recente preprint rapporteerde cellulaire testen van verschillende HIV-proteaseremmers:"Nelfinavir remt de replicatie van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 in vitro .”

We rapporteren de tabel uit de preprint (tabel 1). Dit zijn geen IC50, maar EC50, dus het zegt niet hoe goed deze moleculen aan het protease binden. Dit toont echter aan dat al die verbindingen de replicatie van SARS-CoV-2 remmen en dat sommige actiever zijn dan andere.

Ritonavir en lopinavir werken samen met veel residuen die eerder werden gezien in andere verbindingen die gericht zijn op SARS-CoV-protease (Fig. 8 en 9). Hoewel er verschillende klinische onderzoeken lopen met een combinatie van die twee moleculen, zijn er helaas geen IC50-gegevens beschikbaar voor Ritonavir of Lopinavir op SARS-CoV-2.

Figuur 8 :Best gescoorde pose voor Ritonavir:en 2D-interactiediagram dat laat zien dat Ritonavir een interactie aangaat met de twee katalytische residuen:CYS145 en HIS41, maar ook GLU166, PRO168 en GLN189 zoals gezien bij andere bekende remmers van SARS-CoV.

Figuur 9 :Best gescoorde pose voor Lopinavir:en 2D-interactiediagram dat aantoont dat Lopinavir een interactie aangaat met de twee katalytische residuen:CYS145 en HIS41, maar ook GLU166, PRO168 en GLN189 zoals gezien met andere bekende remmers van SARS-CoV.V. em>

Nelfinavir (Fig. 10) heeft een hoge voorspelde bindingsaffiniteit in onze berekeningen en is ook gekarakteriseerd tegen COVID19 in een recente preprint:"Nelfinavir is actief tegen SARS-CoV-2 in Vero E6-cellen."

Een tweede preprint laat zien dat Atazanavir actief is op met SARS-CoV-2 geïnfecteerde cellen:"Atazanavir remt SARS-CoV-2-replicatie en pro-inflammatoire cytokineproductie."

Een PDB-structuur 6W63 die een nieuwe remmer voor SARS-CoV-2 bevat, werd gepubliceerd nadat we met dit werk waren begonnen (Fig. 11). Er is geen gepubliceerde informatie over de bindingsaffiniteit van deze verbinding met de SARS-CoV-2 Mpro. De zijketens in de bindingsplaats zijn bijna in dezelfde richting als voor 6LU7. We hebben onze verbindingen gedockt en opnieuw gescoord met MMGBSA-benaderingen zoals eerder  en zeer vergelijkbare resultaten gevonden.

Figuur 11 :PDB-structuur 6W63:SARS-CoV-2 belangrijkste protease in complex met remmer X77.

Perspectieven

De bindingsplaats van SARS-CoV-2-protease is erg groot, bevat vier subsites en kan veel verschillende liganden herbergen met een matige bindingsaffiniteit. Zoals hier uitgelegd, is virtuele screening een handig hulpmiddel om mogelijke remmers te identificeren en kon het ons een structurele verklaring geven over hoe mogelijke remmers een interactie aangaan met het protease.

Al deze hypothesen vereisen echter bevestiging door experimenteel bewijs, zoals meting van IC50, om modellen te bouwen die robuuster zijn.

Hier hebben we geen covalente koppeling uitgevoerd, maar aangezien de meest actieve verbindingen tegen SARS-CoV-protease covalent waren, kan dit een vereiste zijn voor sterke remmers. Covalente remmers vertonen ook voordelen in vergelijking met reversibele remmers, zoals het hebben van een sterke doelaffiniteit en verlengde levensduur bij patiënten.

Om een ​​geneesmiddel bij een patiënt actief te laten zijn, moeten we andere farmacologische aspecten in overweging nemen, zoals farmacokinetiek. Het zal nodig zijn om het vermogen van deze geneesmiddelen om de beoogde plasma- en longconcentraties te bereiken na goedgekeurde dosering bij mensen te evalueren.

Het viel niet binnen de reikwijdte van dit werk om commentaar te geven op ander structuurgebaseerd ontwerponderzoek, omdat dit niet op tijd zou zijn voor de huidige epidemie. Ons doel was om gemakkelijk bruikbare therapieën te beoordelen voor potentiële kandidaat-geneesmiddelen tegen COVID19.

We willen het Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC) bedanken voor toestemming om GOUD te gebruiken voor de virtuele screening in dit werk. GOLD heeft bewezen succes te hebben in virtuele screening, leadoptimalisatie en het identificeren van de juiste bindingsmodus van actieve moleculen. Een interface naar GOLD is beschikbaar in Discovery Studio.